骨肉瘤动物模型新进展

符策岗，赵红卫，刘扬，贺露姣，何梦溪，陈海丹*

(1. 三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院脊柱外科，湖北 宜昌　443000；

2. 三峡大学医学院，湖北 宜昌　443000)



骨肉瘤动物模型新进展

符策岗1，赵红卫1，刘扬1，贺露姣2，何梦溪2，陈海丹1*

(1. 三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院脊柱外科，湖北 宜昌443000；

2. 三峡大学医学院，湖北 宜昌443000)

【摘要】骨肉瘤(osteosarcoma, OS)发病率在儿童和青少年恶性肿瘤中居首位，目前的临床治疗方式以外科手术联合药物化疗为主。虽然已经在很大程度上提高了骨肉瘤患者的生存率，但当肿瘤发生转移时，骨肉瘤患者的5年生存率不足20%。因此利用骨肉瘤动物模型对该疾病进行研究，对进一步探索其病因及研发新的治疗药物或方式显得尤为重要。本文就近年骨肉瘤模型的应用做一简要综述。

【关键词】骨肉瘤；动物；模型

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)好发于儿童、青少年及部分成年人，但在25～59岁之间骨肉瘤的发病率较低，这表明骨肉瘤发病率可能和骨的生长活动有关。但当超过60岁时，骨肉瘤的发病率又再次升高，而原因可能与湿疹样癌或辐射有关[1, 2]。骨肉瘤好发于股骨远端、胫骨近端和肱骨远端，约10%发生于中轴骨(上颌骨、下颌骨、肋骨、椎骨、头盖骨和胸骨等)和骨盆[3]。目前临床上治疗方式主要以外科手术联合化学治疗为主，虽然在很大程度上提高了患者的生存率，但由于化疗耐药性和肿瘤转移的存在，部分患者的死亡率依然很高。因此，借助各种肿瘤动物模型研究骨肉瘤的发生和发展、开发新型药物和治疗方式对提高OS患者的生存率具有重要意义。

1动物模型分类

图1　骨肉瘤动物模型分类及常用动物模型　　Fig.1　Classification of animal models of osteosarcoma and commonly used animal models

目前现有的分类方式大致将骨肉瘤动物模型分类为两大类：自发型、诱导型肿、肿瘤移植和基因工程。图1。

1.1自发型肿瘤模型

自发肿瘤模型虽然与人类骨肉瘤的生物学性状颇为相似，包括遗传和环境等因素，理论上是很理想的动物模型，但是应用极少，原因是该模型受影响因素多，成瘤时间长，均一性差，很难定时做对比研究，也存在发病率低和稳定性差的问题。

1.2诱导型肿瘤模型

诱导型肿瘤模型虽然破坏了原始的OS诱发过程、肿瘤移植情况下也可能破坏肿瘤的微环境从而影响肿瘤的发展[4-6]，但是依然有许多利用诱导模型研究OS的成功例子[7, 8]，且因为诱发肿瘤模型容易操作，靶器官和诱癌率恒定，诱发形成癌变率高等优势成为现今主要的骨肉瘤动物模型获取方式。诱导型动物模型主要有以下几种诱导方式。

1.2.1物理因素

放射性核素是强致癌物质，几乎所有趋骨性的放射性核素均能引发骨肉瘤。Tinkey等[9]对Sprague-Dawley大鼠后腿进行60Co γ射线照射后4～8个月,观察到这些大鼠发生骨肉瘤。此外还有241Am、239Pu、238Pu、237Np等放射性核素也能诱导OS，但成瘤率并不是100%。

1.2.2化学因子

以一定浓度并持续往动物肌肉内注射化学物质，也能诱导出恶性骨肉瘤，但往往耗时较长，一般在40周以上。这些化学物质包括：硅酸锌铍、黄曲霉毒素B1、亚砷酸盐、7,12-二甲基苯并蒽、4-羟氨基喹啉-1-氧化物、氧化铍、甲基胆蒽、N-羟基、2-乙酰胺芴的铜蛰合物、二乙基亚硝胺等。此外，诱导的肿瘤模型重复性低，且化学物质对科研人员有害，目前实验室已经很少使用此法构建动物模型。

1.2.3病毒

病毒诱导模型相对以上两种方式有耗时较短、重复性高等优点。因此注射病毒株也是构建肿瘤模型常用方式之一。Olson等[10]利用 Moloney 肉瘤病毒，Shan等[11]利用SV40病毒 (Simian virus 40，SV40)都成功构建骨肉瘤模型，且成瘤率都在80%左右。

1.3肿瘤移植

肿瘤移植是指将肿瘤组织块或细胞株移植到动物模型体内某个部位，形成原发肿瘤相同肿瘤，在移植到下一代构建动物型。该法由于操作容易，动物成瘤稳定，均一性好，成瘤率高等优点，现今多用于肿瘤成瘤、治疗、浸润和转移等方面。根据肿瘤来源和接种模型将肿瘤移植分为同种移植和异种移植。

同种移植指用诱导得到的骨肉瘤在分离出肿瘤细胞后, 移植到同种异体或同系动物体内。此法目前多是将鼠源性肿瘤细胞株移植到鼠上构建肿瘤模型。常用的鼠源性细胞株包括K7M2和K12；UMR-106；Dunn和LM8等。于哲等[12]以Sprague-Dawley大鼠为动物模型，在每只大鼠右后肢局部皮下接种105、106和107cells/mL等不同数量级UMR-106骨肉瘤细胞株，发现，接种 107级大鼠肿瘤发生率达到100%，且形体较大，进展迅猛，镜下可见肿瘤内血管丰富，肺转移率达到70%。王忠良等[13]同样利用UMR-106骨肉瘤细胞株构建骨肉瘤模型，同样是1×107cells/mL混悬液注入注入3 周龄SD 大鼠胫骨近端骨髓腔内，每只0.2 mL，结果显示 两组大鼠原位成瘤率及肺转移率均达100%。进一步证实此法构建OS大鼠模型的可行性。潘海涛等[14]将5×106cells/mL对数生长期的LM8骨肉瘤细胞的混悬液0.3 mL，注射至C3h雄性小鼠前侧腋窝皮下，在第5天时可见明显肿块，2周时可形成1.0 cm × 1.0 cm大小的肿块，肿瘤生成率100%。实验发现，在鼠腿部注射5 ×106cells/mL UMR106-01细胞株0.1 mL，成瘤率也可达100%[15]。值得一提的是，大鼠模型的肺转移率相对小鼠较高，更适用于鼠骨肉瘤肺转移模型的建立。

成瘤率普遍高，模型构建也相对容易。Floersheim等[17]在构建小鼠骨肉瘤动物模型异种移植指肿瘤来源和移植的动物模型不是一个物种，相比同种移植多出一重免疫排斥的影响，所以多以裸鼠作为实验模型。此法目前多指将人源性肿瘤细胞株移植到裸鼠上构建肿瘤模型。常用的人源性骨肉瘤细胞株包括MG-63、POS-1、U2-OS、HOS-58及SAOS-2等。Crnalic等[16]将人的胫骨骨肉瘤培养至第32代后，取组织学上完整的瘤块儿植入31只裸鼠胫骨近端，2周内全部致瘤，肿瘤的影像学、组织学及生物特性均与原供瘤者相似，肺转移率更高达100%。裸鼠由于免疫系统缺失，时，运用了一种短期免疫抑制，即对宿主小鼠采用甲基苄肼、环磷酰胺和抗淋巴细胞血清交替处理4～6 d 后，将人的骨肉瘤移植入小鼠皮下获得成功，致瘤率100%，也能很好的构建异体模型。此外，近年斑马鱼异种移植由于其骨肉瘤模型构建迅速，也被用于研究特定基因的作用[18]。

肿瘤移植在同种移植和异种移植的基础上又分为同位移植和异位移植。原位移植是将骨肉瘤细胞或组织接种到与原发部位相对应的动物器官组织内所构建的骨肉瘤动物模型。异位移植是将骨肉瘤细胞或者组织块移植于骨骼以外的部位,主要是皮下移植和静脉移植。实验发现，相对于异位移植，原位移植骨肉瘤的潜伏期短、生长快、侵蚀性强，因此更适用于骨肉瘤动物模型的建立[19]。

1.4基因工程

随着表观遗传学的发展，已经证实肿瘤的发生和发展伴随多种癌基因和抑癌基因表达的改变。利用分子技术改造相关基因构建肿瘤模型能更好地模拟人体内生理、病理环境, 与所研究肿瘤的发生过程具有较好的一致性, 而且可模拟部分癌前病变。基因人工敲除和敲入在动物体内的研究有利于揭示肿瘤的分子机制, 为人类骨肉瘤研究提供全新的途径。此类骨肉瘤相关基因包括：p53[20]、RB[21]、C-FOS[22]、TWIST[23]、p14ARF[24]、p16INK4a[25]、TWIST[26]、NF2[27]、P27[28]PRKAR1A[29]和p21CIP[30]。其中除C-FOS、TWIST和TWIST属于癌基因外，其他均属于抑癌基因。沉默抑癌基因和增强癌基因的表达是构建转基因模型常用的方式。

其中沉默抑癌基因p53和RB常被用于构建OS模型。实验证实，鼠p53基因沉默能诱导OS的发生，说明p53突变在诱导骨肉瘤发生过程中发挥重要作用[31, 32]。虽然仅沉默RB基因不会诱发OS[33, 34]。但大量实验数据通过单独沉默p53或协同沉默Rb证实了，在沉默p53的基础上，共同沉默Rb信号通路能显著加快肿瘤发展[35-41]。此外，p53基因沉默也成功构建了斑马鱼转基因模型[42]。转基因动物模型也有自身的不足，此法诱导的骨肉瘤模型85%好发于中轴骨(上颌骨、下颌骨、肋骨、椎骨、头盖骨和胸骨等)，仅有16.3%发生于四肢骨(后足和前足)，这就与人类骨肉瘤的好发部位形成了矛盾[39]。因此，转基因动物模型仍需进一步研究改良，尝试其他相关抑癌基因联合沉默、共同增高几种癌基因表达或者沉默抑癌基因联合增高癌基因表达等方法，也许能提高基因骨肉瘤模型构建的成瘤率和特异性。

2讨论

理想的动物模型对了解肿瘤的发生和发展、新型药物和治疗方式的研发具有重要的意义。本文列举了多种骨肉瘤肿瘤模型建立方式。自发型OS模型虽然对研究OS的发病机制和病理学改变具有重要的指导意义，但多数自发肿瘤模型多见于成年犬类，且发病迅速，这与OS常发育儿童和青少年存在矛盾。诱发型OS模型相对自发性OS容易获取，并稳定，因此目前作为主要的OS模型获取方式，并适用于多种实验研究。但由于诱导方式在一定程度上影响了肿瘤的微环境，这也影响了对OS发病机制和病理特点的研究。相对而言，虽然转基因模型建立技术目前仍处于初期，但是建立的动物模型能更好地模拟人体内生理、病理环境, 与所研究肿瘤的发生过程具有较好的一致性, 而且可模拟部分癌前病变。因此转基因动物模型在帮助了解OS的发病机制、病例变化以及药物研发等方面都具有良好的发展前景。但，转基因模型也存在自身的局限性，虽然多种基因与骨肉瘤的发病有关，但目前仍多以沉默p53和Rb为主要研究方向，并且诱导出来的骨肉瘤仅有16.3%发生于四肢骨。因此仍需更多的实验去研究其它骨肉瘤相关癌基因或抑癌基因的表观遗传学变化，尝试联合沉默抑癌基因、联合增强癌基因表达或者沉默抑癌基因联合增强癌基因表达等，从而提高骨肉瘤转基因模型构建的成瘤率和特异性，为骨肉瘤转基因模型构建打下坚实基础。

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关于推荐2016年度陈嘉庚科学奖

及陈嘉庚青年科学奖候选人的通知

应陈嘉庚科学奖基金会的邀请，中国实验动物学会将推荐2016年度陈嘉庚科学奖和陈嘉庚青年科学奖候选人各1名,参加奖项评选。

陈嘉庚科学奖是以对我国科教事业发展做出杰出贡献的著名爱国侨领陈嘉庚先生的名字命名的科学奖励。它的前身是1988年设立的陈嘉庚奖。2003年2月，经国务院同意，中国科学院和中国银行共同出资成立陈嘉庚科学奖基金会，设立陈嘉庚科学奖。2010年，考虑到国际上对青年奖的重视以及我国目前青年奖的设置数量和水平与我国科技发展现状不相适应的状况，为了激励更多的青年科技工作者献身科技事业，陈嘉庚科学奖基金会又新设立了陈嘉庚青年科学奖，奖励获得原创性成果，主要研究工作在中国境内完成，年龄在40周岁以下的青年科技人才。

希望各单位积极组织参与，推荐2016年度陈嘉庚科学奖和陈嘉庚青年科学奖候选人合适人选。

推荐详情请见中国实验动物学会网站发布的信息：http://www.calas.org.cn/html/zxbg/tzgg/20150413/2272.html

截止日期：2015年6月10日。

综述·进展

New progress in animal models of osteosarcoma

FU Ce-gang1, ZHAO Hong-wei1, LIU Yang1, HE Lu-jiao2, HE Meng-xi2, CHEN Hai-dan1

(1.Department of Spinal Surgery, the First College of Clinical Medical Sciences,

China Three Gorges University, Yichang, Hubei Province 443000, China.

2.The Medical College of China Three Gorges University, Yichang, Hubei Province 443000,)

【Abstract】Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant bone tumor in children and adolescents. Currently, the combination of surgical resection and chemotherapy is the main method of treatment for OS in the clinic. Although, the survival rate has been greatly improved in OS patients with localized disease, the 5-year survival rate has remained <20%. It is very important to understand the cause of disease, to develop novel drugs or therapeutics, and to learn the disease through animal models. This review will introduce the progress of animal models of osteosarcoma over the last years.

【Key words】Osteosarcoma; Animal; Models

[收稿日期]2014-11-15

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.021

【中图分类号】Q95-33，R738.1

【文献标识码】A

【文章编号】1005-4847(2015) 02-0216-05

[通讯作者]陈海丹(1982-)，男，博士，研究方向：免疫学。Email： wenquanchd@sina.com

[作者简介]符策岗(1991-)，男，硕士研究生，专业：骨外科。Email： fucegang005@sina.com

[基金项目]国家自然科学基金(NO.81302346)。