坎地沙坦对高糖诱导大鼠A7r5细胞增殖的干预作用

林　威　陈素娟

(福建医科大学附属协和医院干部病房，福建　福州　350001)



坎地沙坦对高糖诱导大鼠A7r5细胞增殖的干预作用

林威陈素娟1

(福建医科大学附属协和医院干部病房，福建福州350001)

摘要〔〕目的探讨坎地沙坦对高糖诱导大鼠A7r5细胞增殖的干预作用。方法常规培养A7r5细胞，通过高糖5、15、20、30、40 mmol/L干预细胞6、12、24、36、48 h，以20 mmol/L高糖干预细胞再经过浓度10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L坎地沙坦处理细胞48 h，并且设置对照组，四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定吸光度值(OD值)、酶联免疫吸附法(ELISA)测定血管紧张素(Ang)Ⅱ水平表达。结果高糖干预A7r5细胞6、12、24、36、48 h后，随着高糖浓度升高OD具有上升趋势，并且在高糖20 mmol/L、干预48 h时OD值最高。坎地沙坦浓度为0、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L干预细胞48 h后，OD值逐渐降低，其中坎地沙坦浓度为0.001、0.000 1 mmol/L与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。高糖浓度20、30、40 mmol/L高糖浓度干预后AngⅡ水平较5 mmol/L干预时升高(P<0.05)；0、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L不同浓度坎地沙坦作用于20 mmol/L高糖诱导大鼠A7r5细胞48 h，AngⅡ水平逐渐降低，但无统计学差异(P>0.05)。结论高糖可以诱导大鼠A7r5细胞增殖明显上升、AngⅡ水平升高，但坎地沙坦干预后可以抑制A7r5细胞增殖。

关键词〔〕细胞增殖；A7r5细胞；坎地沙坦

1福建中医药大学病理教研室

第一作者：林威(1976-)，男，硕士，主治医师，主要从事老年医学方面的研究。

糖尿病(DM)是心血管系统疾病的危险因素，可能直接诱导动脉粥样硬化(AS)的发生，诱导血管内皮细胞变化等〔1〕。血管平滑肌细胞在AS中起着重要作用〔2〕。坎地沙坦是选择性血管紧张素(Ang)Ⅱ受体(AT1)拮抗剂，通过与血管平滑肌AT1受体结合而拮抗AngⅡ的血管收缩作用，从而降低末梢血管阻力〔3〕。本文旨在探讨坎地沙坦对高糖诱导大鼠血管平滑肌细胞A7r5增殖的作用。

1资料与方法

1.1主要材料与仪器大鼠A7r5细胞购自上海生物试剂科技有限公司，HycloneDMEM无糖血清，Hyclone胎牛血清，胰酶消化液(0.25%Trypsin+0.02%EDTA)，噻唑蓝(MTT，250 mg粉状配置终浓度为5 mg/ml)；Baseclick 细胞增殖和毒性检测试剂盒；大鼠AngⅡ酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自南京建成生物研究所；兔抗鼠一抗AT1购自碧云天生物技术研究所；山羊抗兔二抗购自碧云天生物研究所；高糖诱导剂购自南京生兴生物技术有限公司；坎地沙坦(重庆圣华曦药业股份有限公司，国药准字H20041988，2010-04-08，规格8 mg)。美国宝特ELX-808 酶标仪；倒置荧光显微镜。

1.2研究方法

1.2.1细胞培养大鼠A7r5细胞从冻存管中取出常规复苏，置于12%胎牛血清中培养，每个培养瓶中4 ml，37℃，5%CO2培养箱中培养，观察细胞生长状态，隔天换液。

1.2.2高糖诱导剂配置配置目标母液浓度为0.5 mmol/L，称取9 g高糖溶于100 ml超纯水中，玻璃棒搅拌完全溶解后液氮罐低温冻存杀菌，待用。实验设置染毒浓度梯度：0(对照组)、5、15、20、30、40 mmol/L，配置采用无糖DMEM配置。

1.2.3干预药物配置配置坎地沙坦母液终浓度为10 mmol/L，取坎地沙坦研钵研碎称取5 mg，溶于11.3 ml的无糖DMEM中，滤器过滤，-20℃保存备用。实验设施浓度梯度：0(对照组)、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L。

1.2.4实验分组96孔板上设置对照组；高糖诱导组；高糖诱导加干预药物组，每个剂量组设置5个复孔。首先根据MTT实验筛选高糖诱导细胞增殖在0.8附近浓度，再控制高糖浓度行药物干预，其中对照组给予相同剂量的生理盐水干预。

1.2.5MTT测定细胞吸光度取对数期生长较好的大鼠A7r5细胞，经过胰酶消化，计数后按照8 000个细胞/孔(200 μl)铺于96孔板，板周围应用磷酸盐缓冲液(PBS)隔离，每个浓度设置5个复孔，设置调零孔。进行细胞培养等细胞铺满孔底70%，应用5、15、20、30、40 mmol/L高糖诱导剂干预，将细胞培养于37℃，5%CO2培养箱中6、12、24、36、48 h吸取培养，PBS冲洗2遍，每孔分别加入180 μl培养和20 μl MTT于37℃，5%CO2培养箱中4～6 h，吸取培养液加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)于酶标仪测定吸光度值(OD)，波长为550 nm，根据OD值计算细胞增殖率，分析细胞增殖达高峰时高血糖浓度和干预时间，确定浓度和时间后再由10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L坎地沙坦干预48 h，再次酶标仪测定OD值，细胞增殖率=(实验孔-调零孔)/(对照组-调零孔)×100%。

1.2.6AngⅡ蛋白测定AngⅡ蛋白测定采用ELISA法，取对数期生长良好的A7r5 细胞，按照30×104个/孔铺于6孔板中，于CO2培养箱中培养，等细胞铺满70%时，分别应用5、15、20、30、40 mmol/L高糖诱导剂干预，每个浓度梯度设置3个复孔，培养48 h，吸取上清液1 ml到1.5 ml EP管中待用，按照ELISA试剂盒步骤严格进行测定AngⅡ蛋白水平。根据测定结果分析细胞增殖达高峰时血糖浓度，再由10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L坎地沙坦干预48 h，测定AngⅡ蛋白水平。

1.3统计学方法应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析、Dunnett-t检验。

2结果

2.1高糖对大鼠A7r5细胞增殖的影响不同浓度梯度高糖干预大鼠A7r5细胞6、12、24、36、48 h后，经过MTT法检测细胞增殖能力，结果显示随着高糖浓度升高OD具有上升趋势，干预6 h时，高糖40 mmol/L；12 h，高糖20、30、40 mmol/L；24、36、48 h，高糖5、15、20、30、40 mmol/L，分别与对照组相比，均具有统计学意义(P<0.05)，并且在高糖20 mmol/L，干预48 h时OD值最高。见表1。

高糖浓度(mmol/L)6h12h24h36h48h对照组0.41±0.050.40±0.020.41±0.040.41±0.030.42±0.0150.42±0.120.43±0.110.54±0.131)0.54±0.121)0.62±0.031)150.43±0.140.47±0.200.57±0.231)0.64±0.361)2)0.65±0.241)2)200.43±0.250.54±0.271)0.56±0.331)0.83±0.211)2)3)1.13±0.461)2)3)300.45±0.210.56±0.321)3)0.62±0.451)2)0.76±0.151)2)3)4)0.83±0.181)2)3)4)400.52±0.261)3)4)0.58±0.281)3)0.63±0.351)2)3)4)0.72±0.361)2)3)4)0.84±0.271)2)3)4)

与对照组比较：1)P<0.05；与5 mmol/L组比较：2)P<0.05；与15 mmol/L组比较：3)P<0.05；与20 mmol/L组比较：4)P<0.05

2.2坎地沙坦对高糖诱导细胞增殖干预作用不同浓度梯度坎地沙坦作用于20 mmol/L高糖诱导大鼠A7r5细胞48 h，经过MTT检测OD值，结果显示坎地沙坦浓度为0、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/LOD值分别平均为(0.42±0.01)、(1.13±0.46)、(1.10±0.21)、(0.98±0.35)、(0.64±0.24)，其中坎地沙坦浓度为0.001、0.000 1 mmol/L与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。

2.3高糖诱导和梯度坎地沙坦干预后细胞增殖AngⅡ水平表达5、15、20、30、40 mmol/L高糖浓度干预细胞后，AngⅡ水平分别为(55.23±2.35)、(56.25±1.28)、(65.12±2.34)、(64.23±2.45)、(64.45±2.36)ng/L，其中20、30、40 mmol/L高糖浓度干预后AngⅡ水平较5 mmol/L干预时升高(P<0.05)；0、10、0.1、0.001、0.000 1 mmol/L坎地沙坦作用于20 mmol/L高糖诱导大鼠A7r5细胞48 h，AngⅡ水平分别为(65.12±2.34)、(63.96±1.23)、(63.67±2.23)、(63.23±1.36)、(62.30±1.34)ng/L，各浓度间差异无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

血管平滑肌细胞是血管壁重要组成部分，也是AS发生的重要变化细胞〔4〕。在AS形成过程中，血管内皮细胞从血管壁逐渐迁移到血管膜，并且异常增生，血管逐渐变得狭窄，就会继发血栓等栓塞性疾病，因此寻找抑制血管平滑肌细胞增殖的药物或者成分对于预防和治疗AS至关重要〔5〕。DM患者以长期的高血糖为主要表现形式，高血糖是心血管系疾病发生的重要危险因素〔6〕，同时可以增加心脏的氧化应激和升高炎症因子的表达，逐渐引起血管功能下降〔7〕。对高血压患者进行的试验显示〔8〕：患者多次服用坎地沙坦可致血浆肾素活性、AngⅠ浓度及AngⅡ浓度升高，2～8 mg/d连续用药可以控制患者血糖水平，从而控制心血管系统疾病发生〔9〕。另有研究表明坎地沙坦对乳腺癌细胞具有明显抑制作用，其机制可能与坎地沙坦调节细胞周期及凋亡相关蛋白的表达有关，因此设想坎地沙坦对细胞增殖可能具有一定的抑制作用。

本文说明坎地沙坦对于A7r5细胞增殖发挥抑制作用，可间接降低AS发生；同样经坎地沙坦处理后，AngⅡ水平也出现降低趋势，从机制方面说明坎地沙坦具有一定抑制细胞增殖的作用，临床其他动物实验具有相同的研究结果〔10〕。坎地沙坦为AngⅡAT1受体拮抗剂，通过与血管平滑肌AT1受体结合而拮抗AngⅡ的血管收缩作用，从而降低末梢血管阻力，降低AS发生。但是对于坎地沙坦对血管内皮细胞是否具有一定的毒性或者长时间使用可能会产生哪些副作用，还不清楚，还需要进一步的深入研究。

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〔2015-07-15修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

中图分类号〔〕R58〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7049-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.036