microRNA-21与大鼠肝癌微环境中Th17细胞和Treg细胞表达的相关性

姚绍鑫　张贵松　曹宏霞　宋　光　李藏妥　张卫涛

(河北医科大学附属唐山工人医院介入科，河北　唐山　063000)



microRNA-21与大鼠肝癌微环境中Th17细胞和Treg细胞表达的相关性

姚绍鑫张贵松1曹宏霞宋光李藏妥张卫涛

(河北医科大学附属唐山工人医院介入科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的研究miRNA(miR)-21与大鼠肝癌微环境中Treg/Th17比值的相关性。方法使用二乙基亚硝胺构建大鼠肝癌模型，检测肝癌大鼠外周血中Treg细胞和Th17细胞的含量，并检测外周血中miR-21的表达含量，分析miR-21含量与Treg/Th17比值的相关性。结果肝癌大鼠外周血中Th17细胞占总的CD4+T细胞含量的5.319%，较对照组增加；同时，Treg细胞占比约为9.472%，较对照组增加；Treg/Th17的比值在模型组大鼠中为1.781，在正常组中为1.478；miR-21在肝癌大鼠外周血中含量增加，并且与Treg/Th17的比值正相关。结论miR-21的表达水平与Treg/Th17的比值具有正相关性。

关键词〔〕肝癌；Th17细胞；Treg细胞；miR-21

1滦县人民医院介入科

第一作者：姚绍鑫(1965-)，男，博士，主任医师，主要从事介入医学研究。

原发性肝癌发病机制与多种因素有关〔1〕。目前的研究证实，肿瘤细胞能够逃避免疫监视，从而引起肿瘤发生和发展〔2〕。CD4+T细胞中的两个新亚型即Treg细胞和Th17细胞，在多种肿瘤中都发挥重要的调控作用〔3〕。近年来，很多研究证实，microRNA(miR)与肝癌发生、发展、转移等密切相关〔4〕。但是，miR是否与Treg/Th17参与的免疫平衡相关及具体分子生物学机制目前仍不清楚。本研究采用大鼠肝癌模型研究大鼠肝癌微环境中miR与Treg/Th17细胞亚群平衡的相关性。

1材料与方法

1.1大鼠肝癌模型的建立二乙基亚硝胺购自美国Sigma公司。用生理盐水将二乙基亚硝胺配置成4 mg/ml的溶液，避光保存。购买雄性SD大鼠50只，体重180～220 g，随机分为正常组(n=10)及模型组(n=40)。模型组大鼠腹腔注射二乙基亚硝胺(用药量为20 mg/kg，对照组给予相同剂量的生理盐水)，每周给药3次，持续给药12 w。给药过程中每天观察实验动物的饮食状况、精神状态、体重变化及被毛变化。第16周抽取静脉血，麻醉处死，开腹观察肝脏大体形态后，取出肝脏，甲醛固定后制备石蜡包埋切片，HE染色后进行肝脏病理检查。

1.2Th17细胞和Treg细胞含量的检测将细胞收集到EP管中，2 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤一次，重复操作离心弃上清，加入荧光标记的CD4抗体，避光室温孵育30 min。再用适量PBS洗涤，2 000 r/min离心5 min，弃上清。再分别对Th17细胞和Treg细胞进行标记。对于Th17细胞，加入Th17破膜剂A液100 μl，避光室温放置10 min，再加入适量PBS，2 000 r/min离心5 min，弃上清，再加入B液100 μl，随即加入荧光标记的抗IL-17抗体，避光室温孵育30 min，重复用PBS洗涤一次，再用适量的PBS重悬细胞，再转移至流式专用管中，上机分析；对于Treg细胞，加入Foxp3专用破膜剂500 μl，避光4℃孵育30 min，再用专用缓冲液洗涤，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入5 μl荧光标记的抗Foxp3抗体，避光室温孵育30 min，用PBS洗涤细胞后重悬细胞，转移至流式专用试管内，上机分析。

1.3实时定量PCR检测使用Trizol法抽提分离获得的PBMC细胞中的总RNA，所用试剂盒均购自Promega公司。将抽提得到的RNA按照逆转录试剂盒的操作步骤进行反转录，再进行实时定量PCR检测，所用的PCR仪为ABI 7300，所用试剂为TOYOBO公司的SYBR Green。各基因配套引物：IL-17A：正义：5′-TCCCACGAAATCCAGGATGC-3′，反义：5′-GGATGTTCAGGTTGACCATCAC-3′；IL-17F：正义：5′-GCGTTTCCATGTCACGTAACA-3′，反义：5′-CAGCCCAAGTTCCTACACTGG-3′；Foxp3：正义：5′-GTGGCCCGGATGTGAGAAG-3′，反义：5′-GGAGCCCTTGTCGGATGATG-3′。特异性引物购自锐博公司。

1.4统计学分析采用SPSS11.0软件行t或χ2检验。

2结果

2.1大鼠肝癌模型的建立与评价随给药时间延长，与对照组相比，模型组大鼠精神状态明显变差，饮食状况下降，体重增长缓慢，反应迟缓，被毛杂乱且无光泽。第16周进行病理检查，可见肝细胞具有核大、染色深等肝癌细胞典型特征，并呈现明显的不典型增生，排列呈团块状或条索状，并出现向周围正常肝细胞的浸润生长(图1)。本实验中，死亡率为7.5%(3/40)，在第16周时成癌率高达81.1%(30/37)。

图1　大鼠肝癌模型第16周肝脏细胞形态

2.2大鼠肝癌模型外周血中Treg/Th17的水平30例大鼠肝癌样本外周血中Th17细胞(CD4+，IL17+)在所有CD4+T细胞中的比值为5.319%，对照组为3.721%，两组之间具有统计学差异(P<0.001)；外周血中Treg细胞(CD4+，Foxp3+)在所有CD4+T细胞中的比值为9.472%，对照组为5.498%，两组之间也具有统计学差异(P<0.001)；Treg/Th17比值在模型组中为1.781，高于正常组1.478(P<0.001)。

实时定量PCR结果显示，模型组IL-17A，IL-17F和Foxp3的表达水平均显著高于正常组(P<0.05)。

2.3大鼠肝癌模型外周血中miR-21的表达水平与Treg/Th17比值的关系模型组外周血中miR-21的含量明显高于正常组。miR-21的水平与Treg/Th17的比值呈正相关(R2=0.627 3，P<0.001)。

3讨论

Th17细胞和Treg细胞属于CD4+T淋巴细胞，但不同于Th1细胞和Th2细胞。Th17 细胞可以分泌白介素(IL)-17，能够在过敏性疾病和自身免疫性疾病发病中发挥重要作用。而CD4+CD25+Treg细胞具有对抗炎症和维持自身免疫耐受的作用，进而使免疫系统处于平衡状态。Th17 细胞与Treg细胞功能上相互抑制，自身免疫性疾病中Th17/Treg失衡，二者的平衡状态在维持免疫系统的稳态中具有重要的作用〔5，6〕。

在肝癌细胞中一系列miR出现表达异常，这些miR的异常表达可能会发挥“癌基因”或“抑癌基因”的功能〔7〕。miR-21是肝癌中研究较多的miR，Hu等〔8〕报道miR-21能够通过调控靶基因HEPN1促进肝癌细胞的增殖；Wang等〔9〕发现miR-21的表达水平能够预测肝癌的预后；Bao等〔10〕发现miR-21能够抑制靶基因PTEN和hSulf-1的表达，从而通过AKT/ERK信号通路促进肝癌的发生发展。但是，miR-21是否与肿瘤微环境中Th17细胞和Treg细胞失衡相关目前仍不清楚。

miR是否参与肿瘤微环境中Th17细胞和Treg细胞的平衡失调目前研究较少，Lv等〔11〕报道miR141-CXCL1-CXCR2信号诱导的Treg招募能够调节非小细胞肺癌的转移和存活率；Dong等〔12〕报道在类风湿关节炎患者中，miR-21表达降低与Th17细胞和Treg细胞比例的失衡具有相关性。尽管本研究中miR-21表达上调与Th17/Treg比例正相关，但还需要研究其具体的分子生物学调控机制，为疾病的诊断和治疗提供新靶点。

参考文献4

1Nault JC，Villanueva A.Intratumor molecular and phenotypic diversity in hepatocellular carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2015;21(8):1786-8.

2Martinez-Bosch N，Navarro P.Targeting Galectin-1 in pancreatic cancer：immune surveillance on guard〔J〕.Oncoimmunology,2014;3(8)：e952201.

3Nguyen AH，Berim IG，Agrawal DK.Cellular and molecular immunology of lung cancer：therapeutic implications〔J〕.Expert Rev Clin Immunol，2014；10(12)：1711-30.

4Gong J，He XX，Tian A.Emerging role of microRNA in hepatocellular carcinoma(Review)〔J〕.Oncol Lett，2015；9(3)：1027-33.

5Thakur C，Wolfarth M，Sun J，etal.Oncoprotein mdig contributes to silica-induced pulmonary fibrosis by altering balance between Th17 and Treg T cells〔J〕.Oncotarget，2015;6(6):3722-36.

6Talaat RM，Mohamed SF，Bassyouni IH，etal.Th1/Th2/Th17/Treg cytokine imbalance in systemic lupus erythematosus(SLE)patients：correlation with disease activity〔J〕.Cytokine,2015;72(1)：146-53.

7Chang-Hao Tsao S，Behren A，Cebon J，etal.The role of circulating microRNA in hepatocellular carcinoma〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed),2015;20(1)：78-104.

8Hu S，Tao R，Wang S，etal.MicroRNA-21 promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma partly by targeting HEPN1〔J〕.Tumour Biol,2015;〔Epub ahead of print〕.

9Wang WY，Zhang HF，Wang L，etal.miR-21 expression predicts prognosis in hepatocellular carcinoma〔J〕.Clin Res Hepatol Gastroenterol,2014;38(6)：715-9.

10Bao L，Yan Y，Xu C，etal.MicroRNA-21 suppresses PTEN and hSulf-1 expression and promotes hepatocellular carcinoma progression through AKT/ERK pathways〔J〕.Cancer Lett,2013;337(2)：226-36.

11Lv M，Xu Y，Tang R，etal.miR141-CXCL1-CXCR2 signaling-induced Treg recruitment regulates metastases and survival of non-small cell lung cancer〔J〕.Mol Cancer Ther,2014;13：3152-62.

12Dong L，Wang X，Tan J，etal.Decreased expression of microRNA-21 correlates with the imbalance of Th17 and Treg cells in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.J Cell Mol Med,2014;18：2213-24.

〔2015-08-20修回〕

(编辑李相军)

The correlation between microRNA-21 and Treg/Th17 ratio in the microenvironment of rats with hepatocellular carcinoma

YAO Shao-Xin,ZHANG Gui-Song,CAO Hong-Xia,etal.

Tangshan Hospital Affiliated Hebei Medical University,Tangshan 063000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo study the correlation between microRNA(miR)-21 and Treg/Th17 ratio in the microenvironment of rats with hepatocellular carcinoma.MethodsDiethylnitrosamine was used to build the hepatocellular carcinoma model of rats;the Treg cells and Th17 cells contents in peripheral blood were detected;and the expression of miR-21 was also detected,the correlation analysis between miR-21 expression and Treg / Th17ration was analyzed.ResultsTh17 cells content in peripheral blood in total CD4 +T-cell was about 5.319%,which was more than that of control group;while Treg cells content was about 9.472%,which was also more than that of control group;Treg/Th17 ratio in model group was 1.781,compared with 1.478 in normal group;miR-21 expression was increased in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma in rats,and showed a positive correlation with the ratio of Treg/Th17.ConclusionsThere is a positive correlation between the expression level of miR-21 and the ratio of Treg/Th17.

【Key words】Hepatocellular carcinoma;Th17 cells;Treg cells;microRNA-21

通讯作者：宋光(1982-)，男，主治医师，主要从事介入医学研究。

基金项目：国家十二五科技支撑计划(2012BAI15B06)

中图分类号〔〕R735〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-6971-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.003