NF-κB信号通路的阻断对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡与炎症的影响

齐　晅　田　玉　孙　超　张明峰　靳洪涛

(河北医科大学第二医院免疫风湿科，河北　石家庄　050000)



NF-κB信号通路的阻断对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡与炎症的影响

齐晅田玉孙超张明峰靳洪涛

(河北医科大学第二医院免疫风湿科，河北石家庄050000)

摘要〔〕目的探讨核因子(NF)-κB信号通路的阻断对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞凋亡与炎症的影响。方法分离正常滑膜组织及RA滑膜组织中成纤维滑膜细胞(FLS)，分为正常FLS组(正常组)，RA FLS组(模型组)，NF-κB 抑制剂(PDTC)低、中、高剂量组(2，5，10 μmol/L)(PDTC组)。四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测PDTC对RA FLS细胞活力的影响，Annexin V-FITC流式双染检测各组细胞凋亡情况，酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α，白介素(IL)-1β含量，Western印迹检测各组细胞中环氧化酶(COX)-2，Bax，Bcl-2蛋白的表达。结果与模型组比较，PDTC低、中、高剂量组能显著抑制RA FLS活力，诱导RA FLS凋亡，抑制RA FLS细胞释放TNF-α、IL-1β因子，下调COX-2和Bcl-2表达，上调Bax表达(均P<0.05)。结论阻断NF-κB信号通路能够显著抑制RA FLS细胞炎症并诱导细胞凋亡。

关键词〔〕类风湿关节炎；成纤维滑膜细胞；炎症；凋亡；NF-κB信号通路

第一作者：齐晅(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事风湿病的发病机制及其诊断治疗研究。

类风湿关节炎(RA)会引起滑膜细胞的超常增生，从而造成关节软骨和骨质破坏，最终导致关节强直，畸形及功能障碍〔1〕。成纤维滑膜细胞(FLS)是关节滑膜细胞中最主要的细胞，是滑膜内层组织的重要组成成分，通过释放多种细胞因子，在关节破坏过程中发挥重要作用。滑膜组织增生是RA的主要特点，原因之一为FLS过度增殖造成细胞数目大量增加，从而分泌过量的促炎因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6等，从而侵袭软骨，使得骨质破坏，并最终损害关节软骨。导致滑膜组织增殖另一原因可能是滑膜细胞凋亡不足导致的滑膜细胞增殖和凋亡失衡〔2〕。已有研究报道RA患者滑膜组织中的细胞凋亡率低〔3〕。因此抑制FLS过度增殖所导致的炎症及诱导FLS凋亡可称为治疗RA的有效手段。且RA发病过程与多种信号通路有关，核因子(NF)-κB是主要信号通路之一，在RA滑膜衬里层中高度活化，诱发各种促炎因子分泌，并释放细胞存活信号而减少细胞凋亡〔4,5〕。本文拟采用NF-κB 抑制剂(PDTC)来探讨NF-κB信号通路对于RA FLS炎症及诱导凋亡的作用。

1材料和方法

1.1滑膜组织来源类风湿组滑膜取自2013年5月至2015年5月河北医科大学第二医院骨科或风湿病科因类风湿疾病进行膝关节置换术10例患者，均符合2009年美国风湿病学会联合欧洲抗风湿病联盟新的类风湿关节炎分类标准，其中女7例，男3例，平均年龄45岁，病程空白对照组选自骨科因意外截肢的非类风湿并疾病患者滑膜组织，患者对取材知情并同意。

1.2主要试剂及仪器PDTC，BCA法蛋白定量试剂盒，ECL超敏发光液，β-actin(碧云天生物技术研究所)；TNF-α，IL-1β酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒(美国RB公司分装)；兔抗Bcl-2，Bax单克隆抗体(Epitmics公司)；兔抗环氧化酶(COX-2)多克隆抗体(武汉博士德生物生物工程有限公司)；电泳仪，转印电泳仪，ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；酶标仪(瑞士TECAN集团公司)；-80℃冰箱(美国Thermo公司)。

1.3FLS分离培养在无菌条件下将收集的膝关节滑膜组织磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，去除脂肪组织，用手术剪剪碎，加入胰酶消化30 min后，胶原酶消化3 h，得到单细胞悬液，用DMEM培养基重悬细胞(含10% 胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素)，在37℃和5% CO2培养箱中培养，约5～6 d细胞开始融合，实验使用第2～3代细胞。且实验分为正常FLS组(正常组)，RA FLS组(模型组)，RA FLS+PDTC组(PDTC组)。

1.4MTT法将处于生长对数期的RA FLS进行消化，并调整细胞浓度，接种于96孔板，于37℃和5% CO2培养箱中培养24 h。继续培养24 h，加入PDTC(2，5，10 μmol/L)后每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl，4 h后，弃上清，并每孔加入DMSO 150 μl，10 min后，酶标仪570 nm处测定OD值。

1.5Annexin V-FITC流式细胞法检测细胞凋亡将处于生长对数期的RA FLS进行消化，调整细胞浓度，并接种于6孔板，37 ℃和5%CO2培养箱中培养48 h。按1.3分组方法进行给药，继续培养48 h后，按照Annexin V-FITC/ PI细胞凋亡检测试剂盒说明书的方法，用0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)消化，PBS洗涤，离心，收集细胞；加入Binding Buffer 500 μl悬浮细胞，随后加入Annexin V-FITC 5 μl混匀后，加入PI 5 μl，混匀，于室温避光反应5～15 min，在1 h内进行流式细胞仪检测。

1.6ELISA法检测TNF-α、IL-1β含量将处于生长对数期的RA FLS进行消化，调整细胞浓度，并接种于6孔板，37℃和5%CO2培养箱中培养48 h。按1.3分组方法进行给药，培养48 h，收集细胞上清液，后按各自说明书，通过ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.7Western印迹收集细胞，加入RIPA裂解液，裂解，离心，收获蛋白。根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白上样，SDS凝胶电泳，湿法转膜。一抗孵育，4℃过夜；漂洗后，二抗室温孵育1～2 h。漂洗，滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件对各抗体条带灰度值进行统计。

1.8统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验。

2结果

2.1PDTC对RA FLS细胞活力的影响随着作用浓度的增加，PDTC对RA FLS细胞活力抑制作用逐渐增强，在10 μmol/L时，抑制程度最大，均具有显著差异(P<0.01)；随着24、48、72 h给药时间增加，PDTC对RA FLS细胞活力抑制作用也逐渐增强，其中48、72 h作用强度一致。所以在后续实验中我们选取48 h作为给药时间，见表1。

组别抑制率24h48h72h模型组0.11±0.023.29±0.245.65±0.32低剂量组3.75±0.331)10.49±2.482)10.06±1.132)中剂量组11.32±1.021)20.37±2.182)20.89±2.492)高剂量组19.39±2.112)35.71±4.202)35.67±4.232)

与模型组比较:1)P<0.05，2)P<0.01

2.2PDTC对RA FLS细胞凋亡的影响模型组中细胞凋亡率显著低于正常组(P<0.05)。PTDC低、中、高剂量与模型组相比细胞凋亡率都显著提高(P<0.05)，见表2。

组别早期凋亡晚期凋亡正常组6.4±0.595.1±1.23模型组1.0±2.161)1.8±0.562)PDTC低剂量组7.7±3.13)8.0±2.293)PDTC中剂量组13.2±3.13)10.8±2.293)PDTC高剂量组22.4±0.563)15.1±1.233)

与正常组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.01；下表同

2.3PDTC对RA FLS中TNF-α、IL-1β含量、COX-2的影响模型组中TNF-α，IL-1β、COX-2含量显著高于正常组(P<0.01)。PTDC低、中、高剂量与模型组相比含量均显著下降(P<0.05)，见表3。

组别TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)COX-2相对蛋白含量正常组2.53±0.127.33±1.250.176±0.034模型组8.82±1.242)18.11±1.352)0.779±0.2091)PDTC低剂量组6.79±1.033)15.62±2.363)0.668±0.1851)PDTC中剂量组5.48±0.743)13.46±1.443)0.421±0.1043)PDTC高剂量组4.02±0.693)10.67±1.273)0.221±0.0783)

2.4PDTC对RA FLS中凋亡相关蛋白表达量的影响模型组中Bcl-2表达量显著高于正常组(P<0.01)，Bax表达量显著低于正常组(P<0.01)。PTDC低、中、高剂量与模型组相比Bcl-2表达量显著下降，Bax表达量显著上升(均P<0.05)，见表4。

组别Bcl-2相对蛋白含量Bax相对蛋白含量正常组0.376±0.0390.425±0.034模型组0.978±0.1451)0.143±0.0651)PDTC低剂量组0.768±0.1293)0.269±0.0731)PDTC中剂量组0.556±0.1033)0.321±0.0983)PDTC高剂量组0.397±0.0783)0.245±0.0633)

3讨论

RA是一类以关节病变引起肢体严重畸形的自身免疫性疾病，会引起滑膜细胞的超常增生，具有不死癌症之称。人们对其信号转导途径进行深入研究，发现NF-κB信号转导通路是与RA进程密切相关的信号通路〔5〕。NF-κB能特异性结合多种基因启动子或增强子κB位点，并促进其转录。未受刺激或正常生理条件下时与IκB结合，当受到刺激或在病理条件下，IκB被降解，磷酸化，释放NF-κB p65，使之从细胞质转移到细胞核内，调节炎症和凋亡相关基因的表达。Okamoto等〔6〕利用微卫星和单核苷酸多态性分析RA患者与正常人基因得出，得出NF-κB信号通路在RA中异常活化，且通过抑制NF-κB信号通路能在一定程度上改善RA。Hon等〔7〕临床研究也发现，RA患者滑膜细胞NF-κB表达量增加且活性也明显上升。在体内外药理实验研究中也发现：NF-κB活性在IL-17和TNF-α诱导的RA大鼠滑膜细胞系RSC-364显著提高〔8〕。NF-κB p65在佐剂诱导的小鼠关节炎模型中表达量上升〔4〕。且NF-κB通路的抑制可治疗胶原引起的关节炎〔5〕。说明通过抑制NF-κB信号通路在一定程度上能治疗RA。

在RA的发病过程中，TNF-α及IL-1β等上游促炎因子能激活NF-κB，促进NF-κB亚基向细胞核内转移，使之能够与靶基因如COX-2、Bax及Bcl-2的启动子结合，从而启动靶蛋白的表达。TNF-α是种前促炎因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞分泌，能促进炎症部位白细胞的聚集和活化，从而激发更多促炎因子的产生。IL-1β在传递信息，介导免疫细胞活化，增殖及在炎症反应中起重要作用。COX-2 为前列腺素合成和起始步骤的关键酶，正常FLS细胞中COX-2 表达量较少，当RA FLS释放的大量前促炎症细胞因子刺激时，可迅速大量的表达，并加剧炎症。这些炎性因子可诱导FLS过度增殖和活化，进而分泌多种机制降解酶等，最终导致关节内炎性细胞聚集，滑膜组织增厚，关节结构破坏。在IL-1β诱导的RA FLS中，NF-κB、COX-2表达量提高〔9,10〕。IL-8和IL-1β在RA滑膜细胞系MH7A中含量显著提高〔11〕。TNF-α、IL-1β、COX-2及NF-κB p65表达量都上升〔12〕。通过抑制NF-κB信号通路，可以减少促炎因子TNF-α，IL-1β的分泌〔13〕。Western印迹和免疫组化证实通过抑制NF-κB可降低COX-2表达〔14〕。在RA病人中，IL-6 和 IL-8含量上升，可通过干扰NF-κB表达来抑制其含量提高〔15〕。本实验结果也发现，RA FLS中TNF-α、IL-1β、COX-2促炎因子含量都升高，而NF-κB阻断后，可显著抑制RA FLS释放促炎因子。

在RA FLS中，其细胞增殖能力远大于其凋亡能力，从而促成了RA滑膜的超常增生。Bax、Bcl-2是目前公认的参与细胞凋亡调控作用的最常见癌基因。Bcl-2是在淋巴细胞中发现的能以多种形式抑制细胞凋亡的蛋白。Bax是线粒体膜上的一种促凋亡蛋白。当外界因素启动细胞凋亡时，Bcl-2与Bax形成异源二聚体，且Bcl-2/Bax比值提高，从而启动凋亡级联反应，最后诱导细胞发生凋亡，反之，细胞增殖能力加强。已有研究报道，RA患者中Bcl-2 mRNA含量较高及Bax mRNA含量较低〔16〕。且通过抑制NF-κB信号通路能显著抑制RA FLS细胞增生并诱导细胞凋亡，与提高Bax表达量并下调Bcl-2表达量有关〔17〕。

综上所述，PDTC能显著诱导RA FLS凋亡，抑制RA FLS细胞释放TNF-α，IL-1β因子，下调COX-2和Bcl-2表达，上调Bax表达，从而说明阻断NF-κB信号通路能够显著抑制RA FLS细胞炎症并诱导细胞凋亡。

参考文献4

1Matcham F,Ali S,Hotopf M,etal.Psychological correlates of fatigue in rheumatoid arthritis:a systematic review〔J〕.Clin Psychol Rev,2015;39(1):16-29.

2Kuno H,Kotani T,Takeuchi T,etal.Psoriasis-like eruption induced by adalimumab in a patient with rheumatoid arthritis:a case report and review of literature〔J〕.Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi,2012;35(6):520-5.

3Ekwall AK,Whitaker JW,Hammaker D,etal.The rheumatoid arthritis risk gene LBH regulates growth in fibroblast-like synoviocytes〔J〕.Arthritis Rheumatol,2015;67(5):1193-202.

4Ahmad SF,Zoheir KM,Bakheet SA,etal.Poly(ADP-ribose)polymerase-1 inhibitor modulates T regulatory and IL-17 cells in the prevention of adjuvant induced arthritis in mice model〔J〕.Cytokine,2014;68(2):76-85.

5Okazaki Y,Sawada T,Nagatani K,etal.Effect of nuclear factor-kappaB inhibition on rheumatoid fibroblast-like synoviocytes and collagen induced arthritis〔J〕.J Rheumatol,2005;32(8):1440-7.

6Okamoto H,Yoshio T,Kaneko H,etal.Inhibition of NF-kappaB signaling by fasudil as a potential therapeutic strategy for rheumatoid arthritis〔J〕.Arthritis Rheum,2010;62(1):82-92.

7Hon LJ,Juan TY,Chao P,etal.Plant alkaloid tetrandrine downregulates IkappaBalpha kinases-IkappaBalpha-NF-kappaB signaling pathway in human peripheral blood T cell〔J〕.Br J Pharmacol,2004;143(7):919-27.

8郭亚春，高亚贤，宋鸿儒.薯蓣皂苷片含药血清对IL-17和TNF-α诱导大鼠滑膜细胞株SRC-364 NF-κB p65、STAT3及VEGF影响的实验研究〔J〕.中国中西医结合杂志，2013;33(6):814-8.

9Choi YJ,Lee WS,Lee EG,etal.Sulforaphane inhibits IL-1beta-induced proliferation of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and the production of MMPs,COX-2,and PGE2〔J〕.Inflammation,2014;37(5):1496-503.

10Sung MS,Lee EG,Jeon HS,etal.Quercetin inhibits IL-1beta-induced proliferation and production of MMPs,COX-2,and PGE2 by rheumatoid synovial fibroblast〔J〕.Inflammation,2012;35(4):1585-94.

11Xu J,Itoh Y,Hayashi H,etal.Dihydrotestosterone inhibits interleukin-1alpha or tumor necrosis factor alpha-induced proinflammatory cytokine production via androgen receptor-dependent inhibition of nuclear factor-kappaB activation in rheumatoid fibroblast-like synovial cell line〔J〕.Biol Pharm Bull,2011;34(11):1724-30.

12Sultana F,Rasool M.A novel therapeutic approach targeting rheumatoid arthritis by combined administration of morin,a dietary flavanol and non-steroidal anti-inflammatory drug in domethacin with reference to pro-inflammatory cytokines,inflammatory enzymes,RANKL and transcription factors〔J〕.Chem Biol Interact,2015;230(1):58-70.

13Varani K,Padovan M,Vincenzi F,etal.A2A and A3 adenosine receptor expression in rheumatoid arthritis:upregulation,inverse correlation with disease activity score and suppression of inflammatory cytokine and metalloproteinase release〔J〕.Arthritis Res Ther,2011;13(6):R197.

14Tanwar L,Vaish V,Sanyal SN.Chemoprevention of 1,2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis by a non-steroidal anti-inflammatory drug,etoricoxib,in rats:inhibition of nuclear factor kappaB〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2009;10(6):1141-6.

15Lazzerini PE,Lorenzini S,Selvi E,etal.Simvastatin inhibits cytokine production and nuclear factor-κB activation in interleukin 1beta-stimulated synoviocytes from rheumatoid arthritis patients〔J〕.Clin Exp Rheumatol,2007;25(5):696-700.

17Chang YW,Zhao YF,Cao YL,etal.Bufalin exerts inhibitory effects on IL-1beta-mediated proliferation and induces apoptosis in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes〔J〕.Inflammation,2014;37(5):1552-9.

〔2015-02-17修回〕

(编辑滕欣航)

《中国老年学杂志》征订启事

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通讯作者：靳洪涛(1963-)，男，硕士，主任医师，主要从事风湿病的发病机制及其诊断治疗研究。

中图分类号〔〕R593.22〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7022-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.025