阿尔茨海默病复合动物模型的构建

李　岚　刘　爽　于　燕　宁巧庆　王秀华　张秀丽

(滨州医学院医药研究中心，山东　烟台　264003)



阿尔茨海默病复合动物模型的构建

李岚刘爽于燕宁巧庆王秀华张秀丽1

(滨州医学院医药研究中心，山东烟台264003)

摘要〔〕目的拟在D-半乳糖(D-gal)致衰老小鼠的基础上，将亚硝酸钠/三氯化铝/脂多糖(NaNO2/AlCl3/LPS)分别组合注射入小鼠体内，建立一个较为理想的阿尔茨海默病(AD)复合模型。方法模型组小鼠给予皮下注射D-gal(150 mg·kg-1·d-1)，分别给予不同组合的NaNO2(90 mg·kg-1·d-1)/AlCl3(25 mg·kg-1·d-1)/LPS(5 mg·kg-1·d-1)；对照组给予皮下注射等量的生理盐水。利用旷场、跳台、水迷宫实验进行小鼠行为学检测；生化方法检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量；RT-PCR检测小鼠脑组织Tau和APP mRNA含量。结果D-gal联合NaNO2、AlCl3、LPS能够引起小鼠学习记忆能力降低；脑组织抗氧化能力降低；脑组织中APP与Tau的 mRNA表达水平显著升高。而且，AlCl3+LPS组和NaNO2+AlCl3+LPS组更接近AD病理特征。结论D-gal联合NaNO2、AlCl3、LPS能够较理想地模拟AD，可用于AD病理和筛选治疗药物的进一步研究。

关键词〔〕阿尔茨海默病；亚硝酸钠；三氯化铝；脂多糖

1滨州医学院药学院

第一作者：李岚(1986-)，女，讲师，硕士，主要从事神经生物学研究。

依据阿尔茨海默病(AD)发病学说，目前已有各种各样的AD动物模型，但都存在不同程度的局限性，不能完全模拟AD的特征〔1～3〕。我们设想在D-半乳糖(D-gal)致衰老动物模型的基础上辅以能引起老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)的化学试剂进行AD动物模型的探索。研究表明，小鼠给予腹腔注射铝或口服枸橼酸铝均可造成AD模型〔4～6〕；小鼠给予腹腔注射D-半乳糖(D-gal)+亚硝酸钠(NaNO2)可造AD动物模型〔7,8〕。此外，用脂多糖(LPS)造脑炎模型可用于研究大脑急慢性炎症在AD发病过程中的作用〔9,10〕。针对与SP和NFT形成的相关因素，本实验先通过对D-gal诱导小鼠衰老，再将AlCl3/NaNO2/LPS进行不同组合分别注射于小鼠体内，拟建立一种更为理想的、可靠的AD复合模型。

1材料与方法

1.1试剂和实验动物D-gal、LPS和DEPC购于Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)生化指标检测试剂盒购买于南京建成生物工程研究所；引物探针和荧光定量PCR试剂购于ShineGene；其他试剂均为国产分析纯试剂。健康育龄昆明小鼠，雌雄各半，体重(25.0±3.0)g，3月龄，购自烟台绿叶制药有限公司。

1.2分组和给药小鼠分笼喂养于昼夜节律的温控室内，自由进食水，正式实验前进行维持5 d的环境适应。随机分为正常对照组、模型组Ⅰ(NaNO2+LPS)、模型组Ⅱ(AlCl3+LPS)、模型组Ⅲ(NaNO2+ AlCl3)、模型组Ⅳ(NaNO2+ AlCl3+LPS)，每组10只。四个模型组小鼠分别给予皮下注射D-gal(150 mg·kg-1·d-1)，持续进行6 w；对照组皮下注射等体积生理盐水。按照分组，分别给予不同模型组小鼠皮下注射NaNO2(90 mg·kg-1·d-1)、AlCl3(25 mg·kg-1·d-1)连续6 w；末次给药后第2天，给予相应模型组注射LPS(5 mg·kg-1·d-1)。

1.3行为学实验

1.3.1旷场实验检测小鼠的运动和探究能力。实验环境要求：黑暗、无噪音。将小鼠置于旷场实验箱，允许其自由探索环境5 min。观察记录小鼠在5 min内的行为举动。主要观察小鼠跨越的方格总数目与后肢站立的总次数(包括两个前爪腾空或爬上墙壁)。每只实验动物测试完毕后，需及时进行排泄物的清理，以免留有气味，影响后续的实验。

1.3.2跳台实验检测小鼠被动学习记忆能力。实验装置是分隔为五间小鼠跳台反应箱(10 cm×10 cm×30 cm)，箱底装有铜栅，可通36 V交流电进行连续的电刺激。每个房间的右后角均放有一个直径和高度为4.5 cm的橡皮垫，作为一个安全区，避免对小鼠电休克。在实验中，小鼠被放置在跳台仪中，适应环境3 min，而后底部铜栅接通36 V的交流电，观察动物在受到电刺激以后跳跃上橡皮垫的反应时间以及在5 min之内所受电击刺激的次数(错误次数)，作为学习成绩。训练实验结束24 h后重做测试，小鼠被放置在跳台仪中进行3 min的环境适应，然后，将老鼠放到橡皮垫上，记录小鼠第一次跳下橡皮垫的潜伏时间以及在5 min之内所受电击刺激的次数(错误次数)，作为记忆成绩。

1.3.3Morris 水迷宫迷宫水池高50 cm，直径为120 cm，水池上空有与计算机监视器相连接的摄像机，通过软件对测试动物进行全程追踪，记录动物游泳的轨迹，计算机软件分析出小鼠游过水池各个象限的路程、在各个象限中所待的时间以及动物找到平台所需要的时间(即潜伏期)等参数。水池被等分为4个等大的象限，一个将平台(直径10 cm，高17.5 cm)放置于第三象限，没于水下1 cm，水中倒入墨汁，以实验动物视觉无法明显辨别出平台为宜。在隔音安静的室内进行实验，水温以24℃±2℃为宜。

在正式测试前先进行5 d的前期训练，4次/d，每次持续60 s，2次训练之间需间隔60 s。从平台外的其他三个象限(一、二、四)任选一点将小鼠分别头面向水池壁放入水中，假如小鼠在60 s之内没有找到平台，需要人为将它抓到平台上并停留10 s，再放回笼，此时潜伏期计为60 s。第6天，小鼠在水迷宫内接受记忆检测。试验时撤去平台，然后将小鼠从平台对侧头面向池壁放入水中，记录60 s内第一次经过原平台的时间(潜伏期)、经过平台次数及在原平台所在象限内逗留的时间。

1.4取材及样品制备行为实验结束24 h后麻醉动物，生理盐水经心脏做颅内灌注，冰上快速分离脑组织，用预冷的0.9%生理盐水洗净。将大脑称重后，保存于-70 ℃备用。

1.5SOD活性、GSH-Px酶活力及MDA含量的测定将冻存的右脑组织用冰冷的生理盐水制备成10%的组织匀浆，4℃、4 000 r/min离心10 min，留上清液备用。测定SOD的活力采用黄嘌呤氧化酶法；测定GSH-Px的活力采用二硫双硝基苯甲酸法；测定MDA的含量采用硫代巴比妥酸法，具体操作根据试剂盒说明书进行。

1.6RT-PCR利用Trizol试剂提取脑组织RNA，RT-PCR检测脑组织中Tau和APP的mRNA含量。引物序列，APP：上游序列5′-CAGTGAGCCCAGAATCAGCTAC-3′；下游序列：5′-ACAGAGTCCACCCCAAAAGG-3′。Tau：上游序列5′-CACCCCATCCCTACCAACAC-3′；下游序列5′-GCTGGTGCTTCAGGTTCTCA-3′。β-actin：上游序列5′-GAGACCTTCAACACC CCAGC-3′；下游序列5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′。荧光定量PCR反应体系：94℃ 4 min；94℃ 20 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，反应35个循环；72℃ 30 s。

1.7统计学处理组间比较采用Student-t检验。

2结果

2.1行为学实验

2.1.1旷场实验与正常对照组比较，各模型组小鼠跨越的方格总数和后肢直立次数均明显降低(P<0.01)。其中，与模型组Ⅲ相比，模型组Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ在跨格数和直立次数上降低的幅度更显著，见图1。

2.1.2跳台实验与正常对照组比较，各模型组小鼠在记忆获得测试阶段反应的时间和出现错误的次数明显增加多(P<0.05 )。在记忆重现测试中，各模型组小鼠第一次跳下橡皮垫的潜伏期与对照组相比明显缩小，错误次数明显增大(P<0.05)。表明各模型组小鼠的被动学习记忆能力下降，选择复合药物造模的效果较为理想。见表1。

1～5：正常对照组、模型组Ⅰ、模型组Ⅱ、模型组Ⅲ、模型组Ⅳ，下图同与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01图1　旷场实验结果

组别 训练 记忆力 反应时(s)错误次数潜伏期(s)记忆力正常对照组3.02±1.963.4±0.6203.32±65.021.3±1.3模型组Ⅰ10.72±4.201)5.1±1.31)74.23±43.471)4.3±1.21)模型组Ⅱ11.30±3.481)4.8±1.41)85.34±52.211)4.2±1.81)模型组Ⅲ12.43±3.901)4.7±1.81)93.12±57.101)4.6±1.51)模型组Ⅳ13.11±4.771)5.2±1.91)83.60±62.341)4.7±1.31)

与正常对照组相比：1)P<0.05，下表同

组别SOD组GSH-PxMDA正常对照组300.2±31.93.7±0.63.5±0.8模型组Ⅰ159.4±24.51)1.5±0.31)9.1±0.71)模型组Ⅱ177.3±21.31)1.9±0.21)8.8±0.91)模型组Ⅲ193.62±34.51)1.7±0.181)8.7±1.11)模型Ⅳ191.1±29.41)2.1±0.31)7.5±1.21)

2.1.3Morris水迷宫实验与正常对照组比较，各模型组第一次到达原平台的潜伏期较长，在原平台象限停留的时间较短，穿越原平台的次数也相应减少(P<0.05或P<0.01)。见图2。

2.2脑组织SOD、GSH-Px活力及MDA含量变化相比于正常对照组，各模型组小鼠脑组织中SOD活性和GSH-Px活力均降低(P<0.01)；MDA的含量升高(P<0.01)。见表2。

与正常对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01图2　Morris水迷宫实验空间探索能力实验结果

2.3脑组织中APP和Tau的mRNA含量变化与比正常对照组相比，各模型组脑组织中的APP 和 Tau mRNA的表达量明显增加(P<0.05)，说明NaNO2/AlCl3/LPS诱导的动物模型能够较理想的模拟AD。见图3。

图3　脑组织中APP和Tau mRNA表达量

3讨论

目前，依据AD的发病机制，提出了多种不同的假说：基因突变和多态性学说、能量代谢障碍学说、Aβ级联反应学说等〔11～14〕。现有的AD动物模型有自然衰老模型、损毁模型、转基因模型等，但是，各种模型均仅能在某种程度上进行人类AD的模拟，各有不足之处〔15〕。自然衰老动物虽出现学习、记忆功能的损伤，但是仅有很少能形成NFT及Aβ沉积；损毁模型虽然可以引起学习记忆功能的损伤，但是并不出现SP、NFT，也没有表现出AD病人全身多系统功能的衰老；转基因动物模型虽然能够重现类似于AD患者的部分病理改变，但是，只有少数能呈现学习记忆功能的损伤，结果还不令人满意〔16～20〕。本文拟在D-gal致衰老动物模型的基础上辅以能引起脑内SP和NFT的化学试剂NaNO2、AlCl3进行AD动物模型的探索。因为炎症过程能激活胶质细胞和氧化反应，故选择再加入LPS。行为学实验研究结果表明这三种化合物的不同组合均能引起小鼠探索能力和被动学习能力的降低，损伤空间记忆。

Harman〔21〕指出体内细胞正常代谢中产生的过量自由基会损伤DNA和其他大分子引起细胞死亡并导致退行性疾病，致使机体衰老、大脑老化。D-gal是机体的正常营养成分，过量时被转化为损伤神经元细胞的超氧阴离子自由基，进而导致脑内因子RNA、蛋白质表达水平降低，引起动物学习记忆障碍〔22〕。现有学者提出〔23,24〕，AD患者脑内β淀粉样蛋白肽(Aβ)可以促进自由基的生成，从而对神经元产生细胞毒作用。因此研究脑内自由基代谢对于揭示AD的发病机制是十分重要和必要的。SOD 能够清除超氧阴离子自由基以保护细胞免受其损伤；GSH-Px特异性催化还原型谷胱甘肽对H2O2的还原反应，保护细胞膜结构及功能的完整〔25〕； MDA含量的高低可以反映机体内脂质过氧化的程度、细胞的受损伤程度〔26〕。本研究结果说明脑内抗氧化水平明显降低。

RT-PCR结果显示，相比于正常对照组，各模型组小鼠脑组织内APP和Tau mRNA的表达水平显著升高；而且，AlCl3+LPS组和NaNO2+AlCl3+LPS组升高的程度更为显著。我们将进一步验证这两种模型与AD的相似性，这种AD复合模型不需要颅内穿孔注射，制作简单方便，对于AD发病机制及相关药物筛选的研究具有重要的价值。

参考文献4

1Wang XP,Ding HL.Alzheimer′s disease:epidemiology,genetics,and beyond〔J〕.Neurosci Bull,2008;24(2):105-9.

2Woodruff-Pak DS.Animal models of Alzheimer′s disease:therapeutic implications〔J〕.Alzheimers Dis,2008;15(4):507-21.

3Peng QL,Bua’Zard AR,Lau BH.Pycnogenol protects neurons from amyloid-β peptide-induced apoptosis〔J〕.Brain Res Mol Brain Res,2002;104(1):55-65.

4谢日青，陶涛，陈民利，等.D-半乳糖致衰老模型大鼠的学习记忆和行为学观察及中药干预作用〔J〕.中国比较医学杂志，2010;20(5):32-6.

5章正，罗焕敏.阿尔茨海默病发病机制中相关因素的研究进展〔J〕.中国老年医学杂志,2011;30(3):256-9.

6Mizoroki T,Meshitsuka S,Maeda S,etal.Aluminum induces tau aggregation in vitro but not in vivo〔J〕.Alzheimers Dis,2007;11(4):419-27.

7Shamasundar NM,Rao TS,Naidu MD,etal.A new insight on Al-maltolate-treated aged rabbit as Alzheimer′s animal model〔J〕.Brain Res Rev,2006;52(2):275-92.

8Savory J,Herman MM,Ghribi O.Mechanisms of aluminum-induced neurodegeneration in animals:implications for Alzheimer′s disease〔J〕.Alzheimers Dis,2006;10(2-3):135-44.

9朱燕，周爱玲，茅家慧，等.脑益康对D-半乳糖和亚硝酸钠所致Alzheimer病小鼠模型的保护作用〔J〕.中国应用生理学杂志,2008;24(3):296-300.

10Zhang D,Liu G,Shi J,etal.Coeloglossum viride var.bracteatum extract attenuates D-galactose and NaNO2induced memory impairment in mice〔J〕.Ethnopharmacol,2006;104(1-2):250-6.

11Gao J,Inagaki Y,Liu Y.Research progress on flavonoids isolated from traditional Chinese medicine in treatment of Alzheimer′s disease〔J〕.Intractable Rare Dis Res,2013;2(1):3-10.

12Zhao BS,Liu Y,Gao XY,etal.Effects of ginsenoside Rg1 on the expression of toll-like receptor 3,4 and their signalling transduction factors in the NG108-15 murine neuroglial cell line〔J〕.Molecules,2014;19(10):16925-36.

13Abbasian M,Sayyah M,Babapour V,etal.Intracerebroventricular injection of lipopolysaccharide increases gene expression of connexin32 gap junction in rat hippocampus〔J〕.Basic Clin Neurosci,2013;4(4):334-40.

14Hauptmann S,Keil U,Scherping I,etal.Mitochondrial dysfunction in sporadic and genetic Alzheimer’s disease〔J〕.Exp Gerontol,2006;41(7):668-73.

15Hardy J,Duff K,Hardy KG,etal.Genetic dissection of Alzheimer′s disease and related dementias:amyloid and its relationship to tau〔J〕.Nat Neurosci,1998;1(5):355-8.

16Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease:progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science,2002;297(5580):353-6.

17Lee VM,Goedert M,Trojanowski JQ.Neurodegenerative tauopathies〔J〕.Annu Rev Neurosci,2001;24:1121-59.

18Bossy-Wetzel E,Schwarzenbacher R,Lipton SA.Molecular pathways to neuro degeneration〔J〕.Nat Med,2004;10(Suppl):S2-S9.

19胡梦琳，戴侃纯，张鹏，等.阿尔茨海默病动物模型的研究进展〔J〕.解剖学杂志，2014;37(3):402-4.

20彭彩霞，刘蓉，王建枝.AD转基因模型研究进展〔J〕.神经损伤与功能重建，2007;2(4):197-202.

21Harman D.Free radical theory of aging:Consequences of mitochondrial aging〔J〕.AGE,1983;6(3):86-94.

22Cui X,Zuo P,Zhang Q,etal.Chronic systemic D-galactose exposure induces memory loss,neurodegeneration,and oxidative damage in mice:protective effects of R-a-Lipoic acid〔J〕.J Neurosci Res,2006;83(8):1584-90.

23Butterfield DA,Lauderback CM.Lipid peroxidation and protein oxidation in Alzheimer′s disease brain:potential causes and consequences involving amyloid beta-peptide-associated free radical oxidiative stress〔J〕.Free Radic Biol Med,2002;32(11):1050-60.

24Yamada K,Tanaka T,Han D,etal.Protective effects of idebenone and alpha-tocopherol on beta amyloid(1-42)-induced learning and memory deficits in rats:implication of oxidiative stress in beta-amyloid-induced neurotoxicity in vivo〔J〕.Eur J Neurosci,1999;11(1):83-90.

25Jenner P,Olanow CW.Oxidative stress and the pathogenesis of Parkinson′s disease〔J〕.Neurology,1996;47(6):S161-70.

26Xu PX,Wang SW,Yu XL,etal.Rutin improves spatial memory in Alzheimer′s disease transgenic mice by reducing Aβ oligomer level and attenuating oxidative stress and neuroinflammation〔J〕.Behav Brain Res,2014;264(2):173-80.

〔2014-12-19修回〕

(编辑徐杰)

通讯作者：张秀丽(1974-)，女，副教授，主要从事事神经生物学研究。

基金项目：国家自然基金(81102828,81273037,81341116)，山东省自然基金(ZR2011HM011)；山东省高等学校科技计划项目(J11LF-86)，山东省卫生科技发展项目(HW004)

中图分类号〔〕R964〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6685-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.018