免标记法快速检测牛奶中卡那霉素的研究

王承克，陈　丹,陆　峰，张俊俊

(江苏大学　食品与生物工程学院,江苏　镇江　212032)



免标记法快速检测牛奶中卡那霉素的研究

王承克*，陈丹,陆峰，张俊俊

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212032)

卡那霉素(Kanamycin)是一种被广泛使用的氨基糖苷类抗生素，主要通过与细菌的30S核糖体RNA相互作用抑制其蛋白质合成而起到杀菌作用，对常见的致病菌，如大肠杆菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌有很强的抑制作用[1-2]。由于价格低廉且抗菌性广，卡那霉素作为兽药被广泛使用，然而，由于操作不当或监管不力，实际生产中，卡那霉素被滥用或在饲料中被过量使用，造成其在动物源性食品中存在残留。过量的卡那霉素给人体带来的副作用包括肾毒性、造血系统毒性、过敏性等。卡那霉素对婴幼儿有很强的耳毒性，会导致婴幼儿耳蜗细胞凋亡，严重者会导致听力丧失。因此，动物源性食品中卡那霉素残留的快速定量检测对于保障食品安全非常重要。

目前，常见的卡那霉素检测方法包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)、微生物检测法以及酶联免疫吸附测定法(ELISA)等[3-7]，尽管这些方法能够灵敏检测食品中的卡那霉素，但由于所用仪器昂贵，耗时较长，且操作繁琐，限制了其实际应用。因此，建立一种快速、灵敏、便捷的食品中卡那霉素的检测方法对于保障食品安全很有必要。

适配体(Aptamer)是一种经指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选出的能与待测分子发生特异性相互作用的DNA/RNA片段，具有合成便利、成本低、易于设计、亲和力强、特异性好的优点，被广泛用于小分子的检测[8-11]。另一方面，纳米金(Gold nanoparticle)作为一种新型传感器，具有容易制备、易于功能化和光学性质好等优点，在金属离子、蛋白质、小分子的检测中受到人们的日益关注[12-15]。近年来，也有以适配体功能化纳米金为探针对生物分子进行检测的相关报道，如Chen等[5]利用共振光散射光谱对溶液中的卡那霉素进行灵敏检测；Luo等[16]利用半胱胺功能化纳米金在适配体存在时加入四环素前后溶液吸收光谱的改变，对四环素进行灵敏检测；Chen等[17]利用纳米金和荧光分子修饰的适配体的相互作用，通过测定溶液荧光光谱的改变实现了对卡那霉素的灵敏检测；Peinetti等[18]通过测定纳米金和适配体相互作用后加入磷酸腺苷时阻抗的变化，实现了磷酸腺苷的灵敏检测。然而，由于以上研究需使用荧光光谱仪、电化学工作站等仪器，在快速简便检测小分子方面存在一定不足。本文发展了一种免标记的新方法，基于适配体与卡那霉素特异性的相互作用以及纳米金在分散和聚集状态时吸收光谱的改变，采用实验室常见的固定波长酶标仪实现了牛奶中卡那霉素的高选择性和快速灵敏检测。

1实验部分

1.1试剂与仪器

硫酸卡那霉素、乳糖、啶虫脒、氯霉素、盐酸四环素、红霉素(Aladdin化学试剂有限公司)，赭曲霉毒素A(OTA，新加坡Pribolab公司)，二水合氯金酸(HAuCl4·2H2O，美国Sigma公司)。所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。根据文献[19]选取能与卡那霉素发生相互作用的适配体(5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’)，并由上海生工生物工程股份有限公司合成纯化，使用前溶于去离子水中。

Varian Cary 100紫外可见光谱仪(美国)，Multiscan MK3酶标仪(美国热电公司)。

1.2缓冲溶液中卡那霉素的检测

利用文献方法，使用柠檬酸钠还原氯金酸溶液法制备纳米金[20-21]。向100 μL纳米金溶液中加入终浓度为200 nmol/L的适配体和不同浓度的卡那霉素后，再加入200 mmol/L NaCl溶液，反应10 min，利用酶标仪记录溶液在630 nm处的吸光度值。

1.3牛奶中卡那霉素的检测

取当地超市购置的牛奶(内蒙古伊利乳业，产地马鞍山)10 mL，加入不同浓度的硫酸卡那霉素，再逐滴加入20%乙酸溶液，调至pH 4.5，然后加热至45 ℃，静置10 min，13 200 r/min离心10 min，取中层液，利用“1.2”方法测定溶液在630 nm处的吸光度值[19]。

2结果与讨论

2.1传感器的设计原理

表面包覆有柠檬酸根离子的纳米金由于表面带负电荷，相互排斥，在溶液中保持分散状态，当加入NaCl时，由于NaCl破坏了纳米金表面的双电层，使其稳定性大大降低，从分散状态转变为聚集状态，溶液颜色由红色转变为蓝紫色，相应的溶液光谱发生红移，630 nm处的吸光度值明显增加，如图1所示[22]。当适配体单链DNA存在时，纳米金表面的柠檬酸根被取代，由于DNA侧链磷酸基团与纳米金间的非特异性相互作用，使纳米金带负电，当加入一定浓度的NaCl时，纳米金可以保持一定的稳定性而不发生聚集，溶液颜色仍为红色。而当待测物卡那霉素存在时，由于适配体与卡那霉素的特异性亲和作用，适配体构型发生改变而从纳米金表面脱落，此时再加入NaCl时，纳米金会发生明显聚集，溶液颜色由红色变为蓝紫色。随待测溶液中卡那霉素浓度的改变，纳米金溶液光谱也逐渐改变[23]。基于此可以方便快捷地检测溶液中的卡那霉素。

2.2可行性论证

为验证实验的可行性，在纳米金探针溶液中加入适配体和不同浓度的卡那霉素，最后加入不同浓度的NaCl溶液，当溶液中不含卡那霉素时，溶液光谱最大吸收峰位于520 nm处，而当溶液中存在50 nmol/L卡那霉素时，溶液的最大吸收光谱明显红移，520 nm处的吸光度降低，而630 nm处的吸光度明显增大(如图1)。此现象说明卡那霉素与适配体的结合使纳米金的稳定性降低。基于该性质可用于卡那霉素的检测。为了减少测定时间，简化操作步骤，后续实验选取630 nm作为溶液的特征吸收波长，同时使用了能快速(1～2 s)、高通量测定溶液630 nm处吸光度值的酶标仪。

图1　免标记法检测卡那霉素原理示意图

图2　不同pH值对溶液在630 nm处吸光度值的影响Fig.2　Effect of pH value on absorbance of the solution at 630 nmbuffer：10 mmol/L phosphate buffer;concentration of aptamer：400 nmol/L;concentration of NaCl：250 mmol/L;error bars represent standard deviation of three experimental results

图3　不同浓度卡那霉素存在时溶液在630 nm处吸光度值的变化Fig.3　Absorbance changes of the solution at 630 nm in the presence of different concentrations of kanamycinbuffer：10 mmol/L phosphate buffer(pH 7.5);concentration of aptamer：400 nmol/L;concentration of NaCl：250 mmol/L;error bars represent standard deviation of three experimental results

2.3实验条件的优化

使用免标记法测定卡那霉素，溶液的光谱变化与适配体浓度、NaCl浓度、加入NaCl后的反应时间以及反应体系的pH值等密切相关。为使该传感器获得最佳检测性能，分别对上述实验条件进行优化。

实验结果表明，适配体浓度为400 nmol/L，NaCl浓度为250 mmol/L时，加入卡那霉素前后溶液在630 nm处的吸光度值存在最大差异，在加入NaCl 5 min后，吸光度值保持稳定。因此，实验选择上述反应条件下检测溶液在630 nm处的吸光度值。

对体系pH值进行了优化，pH 5.5～8.5时，溶液在630 nm处的吸光度值均比不含卡那霉素的溶液吸光度值大，且pH 7.5时存在最大差异(如图2)。这可能是由于不同pH值时，纳米金与适配体的亲和力存在差异，同时不同pH值对纳米金稳定性也存在一定影响所致。后续实验采用pH 7.5作为最佳实验条件。

图4　免标记传感器对卡那霉素的选择性实验Fig.4　Selectivity of the label-free sensor between kanamycin and other interfering materialsbuffer：10 mmol/L phosphate buffer(pH 7.5);concentration of aptamer：400 nmol/L;concentration of NaCl：250 mmol/L;concentrations of kanamycin,ochratoxin A,lactose,acetamiprid,chloramphenicol,erythromycin,tetracycline are 50 nmol/L,respectively;error bars represent standard deviation of three experimental results

2.4卡那霉素的检测曲线

在最优实验条件下，考察了该传感器对卡那霉素的检测能力。图3为纳米金溶液中含有不同浓度卡那霉素时630 nm处吸光度值的变化。由图可知，在0～50 nmol/L浓度范围内，溶液在630 nm处的吸光度值随卡那霉素浓度的增加而增强，说明随着卡那霉素浓度的增加，结合在纳米金表面的适配体量逐渐减少，纳米金在NaCl存在时的稳定性也逐渐降低。图3插图显示，在1～10 nmol/L浓度范围内，溶液在630 nm处的吸光度值与卡那霉素浓度呈线性相关，线性方程为OD630 nm=0.367 7+0.003 4ckanamycin，相关系数(r2)为0.99，传感器对卡那霉素的检出限为1 nmol/L。

2.5方法的选择性

考察了该传感器对卡那霉素的选择性，结果如图4所示。在相同实验条件下，当溶液中存在50 nmol/L赭曲霉毒素A(真菌毒素)、乳糖(牛奶中重要成分)、啶虫脒(农药)、氯霉素(抗生素)、红霉素(抗生素)或四环素(抗生素)时，溶液在630 nm处的吸光度值(约为0.35)低于其对于目标分子卡那霉素(50 nmol/L)的响应(0.43)，表明该传感器对卡那霉素的选择性较高，该方法有很好的特异性。

2.6实际样品的检测

为验证该传感器的实用性，对空白牛奶样品进行加标回收实验，加标水平为1,2,5 nmol/L，在最优化条件下采用本方法对卡那霉素进行定量分析(平行测定3次，求平均值)，结果见表1。结果表明，卡那霉素的回收率为94%～96%，相对标准偏差(RSD)均低于5%，说明该传感器能够用于实际样品中卡那霉素的检测。

表1　免标记法检测牛奶样品中卡那霉素的回收率结果

3结论

本文利用卡那霉素与其适配体特异性的相互作用以及纳米金优异的光学性质，构建了一种快速、灵敏检测牛奶中卡那霉素的分析方法。该方法具有较好的灵敏度和特异性，操作简便，有望用于食品中卡那霉素的快速分析。

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摘要：发展了一种利用纳米金探针免标记法检测卡那霉素的方法。适配体能够使纳米金在NaCl溶液中保持一定的稳定性，且溶液呈红色，而当卡那霉素存在时，由于适配体与卡那霉素特异性的相互作用，使纳米金的稳定性降低，当NaCl存在时发生聚集，溶液变为蓝紫色，根据溶液在630 nm波长处吸光度值的改变，利用具有固定波长的酶标仪可实现卡那霉素的快速定量检测。检测线性范围为1～10 nmol/L，检出限为1 nmol/L，检测过程可在5 min内完成。该方法成功用于牛奶中卡那霉素的检测，具有较好的选择性和较高的灵敏度，对食品中抗生素超标等食品安全问题的监控具有重要意义。

关键词：卡那霉素；纳米金；适配体；牛奶

Rapid Detection of Kanamycin in Milk Using Label-free MethodWANG Cheng-ke*,CHEN Dan,LU Feng,ZHANG Jun-jun

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang212032,China)

Abstract：A label-free method was developed for the detection of kanamycin using gold nanoparticles(GNPs).This method was based on the fact that aptamer can make GNPs maintain monodispersed in NaCl solution and keep red color.After adding kanamycin into the solution,due to the specific interaction of aptamers with kanamycin,the stability of GNPs was reduced as the aptamer was firstly interacted with kanamycin and removed from GNPs,which induced GNPs aggregating in the presence of NaCl,and the color of the solution was changed into blue or blue-violet,correspondingly.According to the absorbance change of the solution at 630 nm,the content of kanamycin could be rapidly detected using a simple microplate reader with fixed wavelength.The linear range of kanamycin was in the range of 1-10 nmol/L,with a detection limit of 1 nmol/L.The detection process could be accomplished in 5 min.This method could be used to detect kanamycin in milk samples,with advantages of good selectivity and high sensitivity,and is of great significance to detect the excessive antibiotics addition in food.

Key words：kanamycin;gold nanoparticle;aptamer；milk

中图分类号：O657.3；TQ460.72

文献标识码：A

文章编号：1004-4957(2015)12-1434-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.019

通讯作者：*王承克，博士，讲师，研究方向：食品安全分析，Tel：0511-88780201，E-mail：wangck@ujs.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(21305032)；中国博士后科研基金(2014M551522)；江苏省博士后科研基金(1402073B)

收稿日期：2015-05-04；修回日期：2015-06-01