肝纤维化的血清标志物筛查

邢文斌 刘威 朱承美

肝纤维化的血清标志物筛查

邢文斌 刘威 朱承美

目的探讨与发现肝纤维化的血清标志物。方法采用高效液相色谱-轨道离子阱质谱联用质谱(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技术来分离并提取慢性乙型肝炎(14例)、代偿期肝硬化(20例)、失代偿期肝硬化(15例)患者及健康志愿者(20例)血清中的代谢产物。结果健康对照组、慢性乙型肝炎组、肝硬化代偿期组、肝硬化失代偿期组代谢产物分布存在很大的差异,其中差异最大的代谢产物为羧乙基精氨酸、 辅酶Q1和甘氨脱氧胆酸,并随着肝纤维化程度的加重而增加。结论羧乙基精氨酸、辅酶Q1及甘氨脱氧胆酸三种代谢产物可以作为肝纤维化的血清标志物。

肝纤维化；血清标志物

长期的慢性乙型肝炎病毒感染可以导致肝脏不同程度的肝纤维化甚至肝硬化,但肝纤维化的进展十分隐匿,很多临床诊断为慢性乙型肝炎的患者其肝活检组织学已为肝硬化,甚至许多慢性乙型肝炎病毒感染者一旦确诊即为肝硬化,早期发现和诊断肝硬化对改善患者预后十分必要。本实验采用高效液相色谱-轨道离子阱质谱联用质谱(UPLC/LTQOrbitrap MS)技术来分离并提取慢性乙型肝炎、代偿期肝硬化以及失代偿期肝硬化患者血清中的代谢产物,以期发现肝纤维化的代谢产物标志物群。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2011年10月～2013年9月于烟台市传染病医院就诊的慢性乙型肝炎患者34例,所有患者均接受了肝穿刺病理检查,随机选取于大连市第六人民医院住院治疗的失代偿期肝硬化患者15例。同期选择20例健康志愿者作为健康对照组,肝功正常、病原学检查阴性。所有入组人员在知情同意的前提下,留取空腹血4ml,30min内将血清分离,留取血清,-80℃冰箱冷冻保存备检。

1.2 方法 高效液相色谱-轨道离子阱质谱联用质谱(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技术检测所有受检者血清中的代谢产物。

1.2.1 样品准备 室温下静置解冻血清,取100 μl血清加400 μl甲醇除蛋白,涡旋60 s,13000 rpm离心15min,取上清液400 μl置冷冻浓缩仪冻干。

1.2.2 超高效液相色谱分析 采用超高效液相色谱分析仪。冲洗柱采用10.0cm×2.1 mm×1.7 μm C18柱根据梯度不同而改变的乙腈溶液冲洗,根据物质在柱内停留时间的长短,完成各种代谢产物的分离。

1.2.3 高效液相色谱-轨道离子阱质谱联用质谱(UPLC/ LTQ-Orbitrap MS) 通过采用LTQ-Orbitrap质谱分析仪,对已经分离的代谢产物实行ESI+模式操作。

1.3 确定代谢产物名称 根据精确分子量来分析、研究确定代谢产物名称。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件处理数据。通过Micromass Marker Lynx获取每峰停留时间(tr)和m/z数据对,标准化输出每峰离子密度后,进行主成分分析(PCA)；根据非参数检验结果,寻找差异比较大的代谢产物。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 本实验对临床诊断为慢性乙型肝炎的34例患者进行了超声引导下肝脏穿刺术的组织病理学诊断结果发现,S1期8例,S2期5例,S3期1例,S4期20例。其中慢性乙型肝炎(即组织学分期为S1～S3期)有14例,代偿期肝硬化有20例(即组织学分期为S4期)。

2.2 在SIMCA-P软件中采用自动匹配的方法处理质谱原始数据,建立了PCA模型(见图1)。从模型图中可以看出,健康对照组、慢性乙型肝炎组、肝硬化代偿期组、肝硬化失代偿期组代谢产物分布存在很大的差异,质量控制组(QC)聚合均良好,说明实验较为稳定。

2.3 在PCA的基础上进行空间坐标轴旋转,以消除组内变异对组间分类的负面影响,使组间的差异最大化,建立PLSDA模型(见图2)。图中显示健康对照组、慢性乙型肝炎组、肝硬化代偿期组、肝硬化失代偿期组有较为明显的分开趋势。

2.4 潜在标记物的筛选,对49个患者样本和20个健康志愿者样本做非参数检验,得到483个特征离子碎片,定性出40个差异物质。RSD<20%。对患者组和健康组得到的40个特征离子做ROC曲线。拟合较好,得到三种代谢物：羧乙基精氨酸(octopine)、 辅酶Q1(coenzyme Q1)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)。

3 讨论

长期的慢性乙型肝炎病毒感染可以导致肝脏不同程度的肝纤维化甚至肝硬化,实验中对34例慢性乙型肝炎患者进行肝组织活检,结果发现,S1～S3期14例,S4期20例。即慢性乙型肝炎(即组织学分期为S1～S3期)有14例；代偿期肝硬化有20例(即组织学分期为S4期),占59%,这与在选择肝穿患者时更倾向于早期肝硬化的患者有关。如此可见,临床诊断为慢性乙型肝炎的患者中确实部分存在组织学已达到肝硬化(组织学分期为S4期)诊断的患者,探索和发现肝纤维化的血清标志物是十分必要的。

本实验采用高效液相色谱-轨道离子阱质谱联用质谱(UPLC/LTQ-Orbitrap MS)技术对慢性乙型肝炎、代偿期肝硬化、失代偿期肝硬化三组患者的血清中的代谢物进行检测,建立了PCA和PLS-DA模型,结果找到三种代谢产物,分别是：羧乙基精氨酸、 辅酶Q1、甘氨脱氧胆酸。

精氨酸刺激溶解性鸟苷酸环化酶,降低钙离子浓度,促进NO以自泌的方式调节肝内阻力,使血管舒张,肝脏星形细胞(HSC)松弛,促使肝窦内皮细胞会降低NO的释放,使血管紧张剂与血管舒张剂失衡,导致肝纤维化的形成。辅酶Q是一种脂溶性醌类化合物,能在线粒体膜中迅速扩散,极易从线粒体膜中分离出来。甘氨脱氧胆酸盐(GCDC)属于疏水性胆汁酸,国内外大量的研究表明,疏水性胆汁酸如甘氨脱氧胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸等对原代培养的大鼠肝细胞有明显的凋亡作用［1-3］。胆汁酸通过死亡受体通路和线粒体通路介导可直接激活促进肝细胞调亡的Fas受体及Bax,可使线粒体膜通透性增加,细胞肿胀、溶酶体破坏,释放蛋白酶、细胞因子等有毒物质激发炎症反应,对机体造成损坏,具有较大的细胞毒作用。GCDC可通过影响HL-7702细胞跨膜转导钙离子,导致钙超载和钙稳态破坏,钙离子浓度增加可以刺激PI3K/Akt,Rho激酶,核因子κ B(NF-κB)与MAPK通路,有促进纤维化的作用。甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)和甘氨胆酸(GCA)是共轭胆汁酸。高水平GCDCA和GCA出现在患者血清中表明患者发生严重的肝损伤。

羧乙基精氨酸、 辅酶Q1及甘氨脱氧胆酸三种代谢产物随着肝纤维化程度的加重,呈明显上升趋势,说明与肝纤维化密切相关,可以作为肝纤维化的血清标志物,但三种代谢产物在体内浓度水平决定肝纤维化程度,有待于进一步研究。

［1］Ramm GA,Shepherd RW,Hoskins AC,et al.Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate andhepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cellrecruitment.Hepatology,2009,49(2):533-544.

［2］Higuchi H,Miyoshi H,Bronk SF,et al.Bid antisense attenuates bile acid-induced apoptosis and cholestatic liver injury.J Pharmacol Exp Ther,2001,299(3):866-873.

［3］Takikawa Y,Miyoshi H,Rust C,et al.The bile acid-activated phosphatidylinositol 3-kinase pathway inhibits Fas apoptosisupstream of bid in rodent hepatocytes.Gastroenterology,2001,120(7):1810-1817.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.23.038

2016-11-04］

116031 大连市第六人民医院(邢文斌 刘威)；烟台市传染病医院(朱承美)