左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中μ-calpain及caspase-3表达的影响①

韩丽萍，王海燕，乔　霜，邹艳红，裴艳莹

(1.佳木斯大学附属第一医院, 黑龙江 佳木斯 154003；2.牡丹江医学院第二附属医院，黑龙江 牡丹江 157009)



左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中μ-calpain及caspase-3表达的影响①

韩丽萍1, 2，王海燕1，乔霜2，邹艳红1，裴艳莹1

(1.佳木斯大学附属第一医院, 黑龙江 佳木斯 154003；2.牡丹江医学院第二附属医院，黑龙江 牡丹江 157009)

摘要：目的：通过观察LEV对癫痫大鼠认知情况及海马组织中μ-calpain和caspase-3表达的影响，来探讨LEV的抗癫痫作用及其机制。方法：取3周龄Wistar大鼠随机分为4组：NS组、LEV组、Li-pilo组和Li-pilo+LEV组。采用氯化锂-匹罗卡品诱导建立癫痫大鼠模型，建模成功24 h后，LEV组和Li-pilo+LEV组分别给予200 mg/(kgod) LEV。采用Morris水迷宫评价大鼠的学习与记忆的能力，免疫组织化学法检测各组大鼠海马组织中的μ-calpain及caspase-3的表达水平。结果：①与NS组相比，LEV组的逃避潜伏期和穿越平台次数无显著差异 (P>0.05)；而与Li-pllo组相比，Li-pllo+LEV组的逃避潜伏期显著缩短，而穿越平台次数则显著增加(P<0.05)，但未恢复到正常水平。②与NS组相比，LEV组的μ-calpain和caspase-3的蛋白表达无显著变化(P>0.05)；而与Li-pllo组相比，Li-pllo+LEV组的μ-calpain和caspase-3的蛋白表达则显著减少(P<0.05)，但未恢复到正常水平。结论：LEV 可以改善癫痫大鼠的学习和记忆的能力，该作用可能是通过调节海马组织中的μ-calpain及caspase-3的表达实现的。

关键词：左乙拉西坦；癫痫；μ-calpain；caspase-3

癫痫(epilepsy)是神经系统最常见的疾病之一，全球约有3500万患者，患病率为5%～7%，而我国也约有650万患者正在遭受该病的困扰。癫痫是一组以脑部功能失常为特征的综合征，具有突然的发作性，重复性，和短暂性为特点。可以说是儿童期最为常见的神经系统疾病之一。而癫痫持续状态(status epilepticus, SE)是癫痫的严重状态，是癫痫反复发作或持续状态，可以造成神经细胞的凋亡和坏死，并引起认知功能的损害。左乙拉西坦(Levetiracetam, LEV)作为国际上公认的一种抗癫痫药物(antiepileptic drugs, AEDs)的新品种，凭借其独特的抗癫痫机制，临床效果的高效和安全性及良好的药物动力学特点，目前已经在国内和欧美广泛应用于对癫痫的治疗。LEV具有抗癫痫和神经保护双重作用[1]。王海燕等[2]在研究中发现左乙拉西坦在治疗癫痫的同时,还会改善癫痫大鼠的认知功能。张岩等[3]在左乙拉西坦对癫痫大鼠认知功能的影响研究中也观察到，左乙拉西坦可改善癫痫大鼠的学习记忆能力。本研究主要采用免疫组织化学染色法检测LEV对癫痫大鼠海马组织中μ-钙蛋白酶(μ-calcium-activated non-lysosomal protease，μ-calpain)及半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达的影响，并采用Morris水迷宫法检测大鼠空间记忆和学习能力，来探讨LEV抗癫痫作用的机制及其对认知的影响。

1　材料与方法

1. 1实验动物及模型制备

取三周龄健康Wistar大鼠(55±10g)124只(佳木斯大学动物实验中心提供)，雌雄不限，随机的分为4组：正常对照组(NS)28只，左乙拉西坦对照组(LEV)28只，癫痫对照组(Li-pilo)34只，左乙拉西坦治疗组(Li-pilo+LEV)34只。

参考文献[4]制备癫痫大鼠模型：Li-pilo组和Li-pilo+LEV组的大鼠首日腹腔注射1.27%氯化锂127mg/kg，24h后再给予M胆碱受体阻滞剂丁溴东莨菪碱1mg/kg，30min后腹腔注射1% 匹罗卡品100mg/kg。观察大鼠行为变化的情况。根据Racine分级标准[5]，将达到Ⅲ～Ⅴ级进入癫痫持续状态的大鼠归于致痫成功组；未达到Ⅲ～Ⅴ级的大鼠，继续注射匹罗卡品直至注射次数达到6次，若注射6次后仍未达到标准，则归于致痫不成功组，弃之不要。将造模成功大鼠继续分为Li-pilo组和Li-pilo+LEV组。NS组及LEV 对照组均在相同时间点给予等体积的生理盐水。

1.2方法

1.2.1给药方案

Li-pilo+LEV组和LEV组在成模24h后给予200mg/(kgod) LEV灌胃，Li-pilo组和NS组给予等体积的生理盐水灌胃，每日在相同时间点给予一次灌胃。

1.2.2留取标本及检测指标

(1)癫痫模型制备成功24h后，采用Morris水迷宫法每日测试各组大鼠的行为学指标：①定位航行实验：每天分为2个时间段，每个时间段训练大鼠4次，一共需要4d完成，观察并记录大鼠在60s内找到平台的时间(逃避潜伏期，escapelatency)，反应大鼠空间学习和记忆能力；②空间搜索实验(spatial probe test)：即在第5d将平台撤掉，观察和记录大鼠90s内穿越平台的次数，用于测量大鼠对空间位置的记忆能力。

(2)LEV给药后的第7、14、28天每组随机选取8只大鼠，给予10%水合氯醛麻醉之后，断头处死，分离出大鼠的海马组织，在 -70℃给予保存，免疫组化染色法检测大鼠海马组织中μ-calpain及caspase-3的表达情况。

1.2.3检测试剂

LEV购于美国Sigma公司；μ-calpain及caspase-3抗体及免疫组化试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3统计学方法

2　结果

2.1Morris水迷宫测试

与NS组相比，LEV组的逃避潜伏期和穿越平台次数无显著差异 (P>0.05)；而与Li-pllo组相比，Li-pllo+LEV组的逃避潜伏期显著缩短，而穿越平台次数则显著增加(P<0.05)，但未恢复到正常水平。见表1。

表1　各组Morris水迷宫实验数据比较

组别逃避潜伏期时间(秒) 第1d 第2d 第3d 第4d穿越目标次数(次)NS40.30±6.1332.54±5.4027.05±4.1620.66±3.215.31±0.84LEV39.89±5.5733.56±4.6229.55±4.0620.09±2.735.16±0.81Li-pllo50.76±5.52ab48.28±4.41ab46.21±4.33ab37.10±3.38ab2.68±0.35abLi-pllo+LEV45.64±5.96abc40.02±4.39abc37.25±4.27abc28.22±3.48abc4.28±0.41abcF值8.59518.91038.05149.96529.128P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

注：a与NS组比较，P<0.05；b与LEV组比较，P<0.05；c与Li-pllo组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠海马组织中μ-calpain的表达

与NS组相比，LEV组的μ-calpain的表达无显著变化 (P>0.05)；而与Li-pllo组相比，Li-pllo+LEV组的μ-calpain的表达则显著下降(P<0.05)，但未恢复到正常水平。见表2。

表2　各组大鼠海马组织中μ-calpain的表达(个/高倍视野)

注：a与NS组比较，P<0.05；b与LEV组比较，P<0.05；c与Li-pllo组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠海马组织中caspase-3的表达

与NS组相比，LEV组的caspase-3的表达无显著变化 (P>0.05)；而与Li-pllo组相比，Li-pllo+LEV组的caspase-3的表达则显著下降(P<0.05)，但未恢复到正常水平。见表3。

表3　各组大鼠海马组织中caspase-3的表达(个/高倍视野)

注：a与NS组比较，P<0.05；b与LEV组比较，P<0.05；c与Li-pllo组比较，P<0.05。

3　讨论

长期频繁的癫痫发作不仅可导致患者的智力及认知功能严重受损，更会对精神造成严重影响，最后逐渐丧失工作能力甚至生活能力,甚至危及生命。LEV自上市以来在治疗儿童癫痫方面已表现出耐受性好、与其他AEDs药物相互作用少以及对认知功能影响小等优势[6，7]。王树华等[8]在研究中发现，神经元出现变性、死亡和细胞结构瓦解现象。而μ-calpain和caspase-3都参与了癫痫大鼠海马神经元损伤过程。Calpain广泛存在于神经细胞内。而caspases在细胞凋亡的发生发展过程中处于中心地位。有资料显示，在由癫痫引起海马神经元丢失中，caspase-3发挥了重要的作用[9，10]。本研究结果反映了大鼠空间学习及记忆能力和μ-calpain及caspase-3的改变存在密切联系。与NS组相比，LEV 对照组的μ-calpain和caspase-3的表达量和 Morris 水迷宫测试结果全部无明显差异；Li-pilo组的μ-calpain和caspase-3的表达量明显升高，Morris 水迷宫测试也显示其空间学习及记忆能力较差；经 LEV 治疗后，Li-pilo+LEV组μ-calpain和caspase-3的表达量明显降低，逃避潜伏期短，空间搜索能力强。提示LEV 对癫痫大鼠空间学习及记忆能力无损害作用。LEV 可以改善癫痫大鼠的空间学习及记忆，记忆贮存及再现能力。它能使癫痫大鼠的逃避潜伏期缩短，而空间搜索能力增强。并且LEV的这种作用可能是通过减低癫痫大鼠海马组织中μ-calpain和caspase-3蛋白的表达实现的。这将为临床应用LEV治疗癫痫提供更有效的理论依据。

[1]Trojnar MK, Maek R, Chrocińska M, et al. Neuroprotective effects of antiepileptic drugs[J].Pol J Pharmacol,2002,54(6):557-566

[2]王海燕,王影,聂磊,等.左乙拉西坦对癫痫大鼠认知功能及海马组织中NPY和NCAM-mRNA表达的影响[J].黑龙江医药科学,2013,36(3):3-5

[3]张岩,王海燕,王影,等.左乙拉西坦对癫痫大鼠认知功能的影响研究 [J].黑龙江医药科学,2013,36(2):6-8

[4]陈子怡, 陈树达, 周珏倩, 等. 匹罗卡品诱发癫痫持续状态大鼠模型的改良和鉴定[J]. 解剖学研究, 2011,33(2):131-149

[5]Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure[J]. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972,32(3):281-294

[6]Briggs DE1, French JA. Levetiracetam safety profiles and tolerability in epilepsy patients[J]. Expert Opin Drug Saf，2004，3(5):415-424

[7]Grosso S, Franzoni E, Coppola G, et al. Efficacy and safety of levetiracetam: an add-on trial in children with refractoryepilepsy[J].Seizure, 2005,14(4):248-253

[8]王树华. 癫痫持续状态大鼠海马神经元程序性死亡与μ-calpain相关机制的实验研究[D]. 山东:山东大学,2008

[9]Henshall DC, Chen J, Simon RP. Involvement of caspase-3-like protease in the mechanism of cell death following focally evokedlimbic seizures[J].J Neurochem,2000,74(3):1215-1223

[10]Kondratyev A, Gale K. Intracerebral injection of caspase-3 inhibitor prevents neuronal apoptosis after kainic acid-evoked status epilepticus[J].Brain Res Mol Brain Res,2000,75(2):216-224

中图分类号：R742.1

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2015)06-0061-03

作者简介：①韩丽萍(1979~) 女，黑龙江牡丹江人，学士，主治医师。

通讯作者：邹艳红(1978~)女，黑龙江佳木斯人，硕士, 主治医师。E-mail：25582393@qq.com。

(收稿日期：2015-03-17)