脑挫裂伤后水通道蛋白-4与血脑屏障通透性的相关性①

姜广宇,董　航 ,张文辉, 顾志成,刘劲睿

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)



脑挫裂伤后水通道蛋白-4与血脑屏障通透性的相关性①

姜广宇,董航 ,张文辉, 顾志成,刘劲睿

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：旨在探讨脑挫裂伤急性期水通道蛋白4 (AQP4)在脑水肿发生发展中的作用，了解该病理生理过程中血脑屏障的损伤及通透性增加趋势，并试图揭示出其相关性。方法：免疫组化检测颅内神经组织在脑挫裂伤后AQP4的表达，脑挫裂伤标本来源：36例脑挫裂伤病人急诊手术时所获得的脑挫裂伤灶周围组织；对照组标本来源：8例原发性癫痫病人，手术时所获近似正常脑组织，并分析血脑屏障(BBB)指数。结果：脑挫裂伤早期AQP4呈现高表达，且明显高于对照组(P<0.05)；早期损伤后血脑屏障结构即发生改变，继之血脑屏障结构明显的损害，24h、72血脑屏障破坏是最为严重。结论：脑挫裂伤后AQP4高表达和BBB损伤导致通透性增加，二者可能存在相关性，对脑水肿而言意义重大。

关键词：水通道蛋白4；脑水肿；血脑屏障；脑挫裂伤

脑水肿是脑挫裂伤后最常见的病理生理过程，研究表明，水通道蛋白在脑水肿过程中担当重要角色，调节水的跨膜转运和水平衡[1]。本研究就不同时段脑挫裂伤病人的脑组织中，水通道蛋白4的水平进行测定，同时检测BBB指数，通过检测血脑屏障的损伤，提示脑组织损伤程度，试图探讨脑挫裂伤后相关因素对脑水肿发生的作用的理解。

1　资料与方法

1.1一般资料

佳木斯大学附属第一医院神经外科入院手术治疗的脑挫裂伤病人(2011-01～2012-12)，急诊手术时所获脑挫裂伤组织，单纯硬膜外、硬膜下血肿病例未入组，药物治疗方案基本一致。实验入组病人36例，伤后6～48h，男25例，女11例；年龄25～55岁，平均37.3岁。统计患者颅脑损伤原因:交通事故22例,暴力打击3例,高空坠落9例,摔倒2例,排除其他系统复合严重受伤,减少干扰。术前依据Glasgow评分(GCS)，将此36例脑挫裂伤病人分为3组：轻中型组(GCS：9～15分)11例，重型组(GCS：6～8分)13例，特重型组(GCS：3～5分)15例。并依据创伤后的时间段长短再次分为3组:伤后≤12h组、12～24h组、24～48h组。对照组织来源：8例原发性癫痫病人术中所获，即相对正常脑组织,男5例,女4例,平均38岁。该实验经过佳木斯大学附属第一医院伦理委员会认证通过。

1.2方法

1.2.1标本处理: 标本经10%甲醛固定48h，再经石蜡包埋，5μm切片备用。

1.2.2电镜观察组织超微结构：标本经3%戊二醛溶液固定6h，再经4℃下1%锇酸固定2h后进行脱水包埋，超薄切片，电镜观察。

1.2.3检测AQP4蛋白表达：依次行石蜡包埋，切片，脱蜡，DAB显色，苏木素复染。图片中免疫组化所示平均灰度定量AQP4蛋白，灰度值高，物质表达含量低，反之亦然。

1.2.4BBB 通透性测定：脑室穿刺或腰椎穿刺后行脑脊液检查，并对抽取病人静脉血血清白蛋白进行检测。样本来源：病人静脉血清及脑脊液(CSF)，同时滴定样本中白蛋白及总蛋白，依据二者含量计算BBB指数，方法依据王拥军[3]等提出BBB指数计算公式：BBB指数=脑脊液白蛋白(Albcsf)/血清白蛋白(Albs)。

1.3统计学方法

2　结果

2.1超微结构观察

显微观察见对照组微血管内、皮外基底膜完好，内皮细胞无形态异常，无水肿，血-脑屏障结构完整。脑挫裂伤组织的微血管内皮细胞见肿胀变形，血-脑屏障损伤，出现"泡沫"改变。毛细管壁衬砌结构缺陷，并可见内皮细胞间紧密连接受损。神经元及胶质胞体增大，水肿，胞浆增多，胞核固缩，可见染色质崩解，电子密度高 ，见图1~3。

图1　对照组脑组织超微结构×10000

图2　创伤组脑组织超微结构×10000

图3　血管周围间隙增宽周边空泡样变×10000

2.2AQP4的检测

脑挫裂伤患者病理，伤后6h即见AQP4表达，统计显示，伤后≤12h组、12～24h组、24～48h组3个组急性期48h内，时间与AQP4表达呈正相关，其差异有统计学意义(F=3.783，P<0.05)。与此同时，不同程度的脑挫裂伤(特重型，重型，轻中型)，伤情越重，AQP4表达量越高，差异有统计学显著性(F=3.572，P<0.05)。统计结果提示：48h内，脑挫裂伤严重程度与AQP4表达量正相关；伤后时间与AQP4表达正相关，见图4~5。

图4　对照组AQP4阳性产物(×200)

图5　脑挫裂伤周围AQP4高表达(×200)

≤12h12~24h24~48h轻中型0.183±0.030﹡0.196±0.029﹡0.23±0.022﹡重型0.21±0.021﹡0.232±0.017﹡0.268±0.024﹡特重型0.222±0.040﹡0.242±0.034﹡0.275±0.042﹡对照组0.15±0.0260.15±0.0260.15±0.026

注：观察组与对照组比较均﹡P<0.05。

2.3BBB通透性检测

不同组脑挫裂伤BBB指数均增加，12h、24h、48h各时段BBB指数均较对照组明显升高(P<0.01)，其中24-72h达到高峰(P<0.01)72h后BBB指数开始有所下降;但仍高于对照组 (P<0.01)。

表2　脑挫裂伤后不同时段病人的BBB指数±s)

注：观察组与对照组比较均﹡P<0.01。

3　讨论

水通道蛋白(aquaporin)的发现,提供了水分子跨膜的全新膜蛋白分子结构基础。共计于哺乳动物体内发现13种膜嵌入蛋白 (majorintrinsicpro-tein，Mm)家族。研究发现AQP4的亚型：M1、M23聚集状态决定了其亚细胞分布和功能，其分布有相对的组织特异性，在成熟大脑中AQP4的分布最为广泛。

AQP4在室管膜、蛛网膜、微血管周围胶质以及渗透压感受区高表达。应起调节神经组织水盐代谢作用[4，5]。AQP4蛋白在神经细胞的分布体现出明显的极性趋势，神经元集中区域如核团或神经层的胞体表现高表达，推测AQP4参与与水分子同向转运[6]。近来，Jin等[7]的结果提示AQP4可影响细胞外容积调节K+的摄取，且K+的摄取可能是AQP4依赖性的，AQP4可能协同调节水和K+稳态，影响神经元电信号水平。实验中观察脑挫裂伤后AQP4的表达动态变化规律，证实颅脑损伤后，AQP4表达随时间变化逐渐增加，并且与路脑损伤程度呈正相关性。这与Taya等[8]的研究结果相符合。

BBB是神经系统的保护界面，使神经系统处于相对隔绝的环境，血管源性脑水肿的主要原因就是BBB的损伤。本研究发现，脑挫伤后神经细胞AQP4的表达与BBB指数在48h内变化呈正相关。其结果提示BBB破坏是脑损伤后早期脑水肿的主要原因之一，细胞毒性脑水肿则可能是亚急性期脑水肿的主要原因之一[9]。调控脑挫裂伤时AQP4的表达，减少BBB的损伤和通透性，可能对继发性脑损伤的治疗提供新的临床思路。虽然该研究结果类似于其他实验。本研究只观察病人在脑挫裂伤后急性期(48h内)AQP4的变化特性，由于就诊时间、交通情况、病人术前准备时间等条件约束，未能就伤后2h内和72h后的各种因子特性相类似的探讨。也因样本个体差异，比如年龄、性别、手术操作和病理

标本部位等限制，无法就不同的时段在同一患者颅脑损伤后AQP4检测进行比较，笔者认为，AQP4在脑挫裂伤后BBB指数的改变，及其影响脑挫裂伤后脑水肿的机制，由于不同的研究方法、手段和观测时段，结论可能存在差，需要扩大样本采集时间，改进研究方法，降低个体差异(如性别、年龄、身体状况等)，进一步详细的观察不同时间点，应可得到更加可靠和客观依据，进一步深入研究，预期提高颅脑损伤病人的预后。

参考文献：

[1] Magni F，Sarto C，Ticozzi D，et al. Proteomic knowledge of human aquaporins [J]．Proteomics，2006，6(20)：5637-5686

[2]王拥军．神经病学实验室诊断技术[M]．北京：科技文献出版社，1998：395-398

[3]Agre P，King LS, Yasui M，et al. Aquaporin water channels-from atomic structure to clinical medicine[J]．Physiol，2002，542(1)：3-16

[4]Jin BJ，Zhang H，Binder DK，et al. Aquaporin-4-dependent K+and water transport modeled in brain extracellular space following neuroexcitation[J].Gen Physiol，2013，141 (1)：119-132

[5]廉哓宇,张秀峰,宣兆博,等.水通道蛋白4mRNA在大鼠蛛网膜下腔出血后脑水肿中的表达及尼莫地平对其表达的影响[J].黑龙江医药科学,2009,32(6):7-8

[6]张帆,许国英.水通道蛋白-4与缺血性脑水肿[J].黑龙江医药科学,2005,28(6):80-81

[7]Yang B，Zador Z，Verkman AS．Glial cell aquaporin-4 overexpression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling[J]．J Biol Chem，2008，283(22)：15280-15286

[8]Taya K，Marmarou CR，Okuno K，et al．Effect of secondary insults upon aquaporin -4 water channels following experimental cortical contusion in rats[J]． J Neurotrauma，2010，27 (1):229-239

[9]刘永刚,姜凤,姜尧佳.高血压性脑出血周围脑组织超微结构及脑水肿发生机制研究[J].黑龙江医药科学,2015,38(2):142-145

中图分类号：R642

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2015)06-0027-02

基金项目：①黑龙江省卫计委科研课题，编号：2013-259。

作者简介：姜广宇(1981～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。

通讯作者：董航(1979～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。E-mail:donghang1006@sina.com。

(收稿日期：2015-09-20)