大鼠雪旺细胞培养纯化与鉴定①

宋振宇，关　键 ，关　宏

(1.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯154007；2.齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000)



大鼠雪旺细胞培养纯化与鉴定①

宋振宇1，关键1，关宏2

(1.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯154007；2.齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000)

摘要：目的：通过Wistar大鼠坐骨神经取材，体外预变性与组织块贴壁方法，培养出大量高纯度可以满足临床应用条件的雪旺细胞。方法：取200～250g成年大鼠，脱颈处死，完全浸泡在75%酒精消毒10min，俯卧位取双侧坐骨神经，体外预变性两周，之后加入双酶消化，EGTA试剂纯化雪旺细胞，通过免疫荧光鉴定雪旺细胞纯度。结果：此研究描述一种新颖有效雪旺细胞培养提纯的方法。利用EGTA对雪旺细胞分离比成纤维细胞快的原理提纯，需要大约21d完成。该方法具有操作简单，速度快的优势，比其他先前描述的方法更有效。结论：该实验通过体外预变性获得的雪旺细胞增殖能力强，活性好，易贴壁，而且纯化方法简单易行，在较短的时间内获得高纯度雪旺细胞。

关键词：雪旺细胞；Forskolin；EGTA

雪旺细胞在周围神经再生中起到决定性作用，是其核心组成。周围神经损伤后，其迅速大量增值，与巨噬细胞协同，分泌神经生长因子[1]，同时吞噬变性坏死碎片以及促进轴突再生。因此，雪旺细胞的研究，对周围神经再生起到主导作用[2]。因为成纤维细胞要比雪旺细胞的增殖快，两者的分离提纯成为一个复杂的过程。采用预变性的方法要比完整的神经取材要更容易获得活性好和高浓度、高纯的雪旺细胞。目前，组织工程学中，把高浓度的雪旺细胞移植到生物材料人工神经管道内来修复神经损伤促进神经再生有重要突破[3]。

1　材料与方法

1.1材料

主要试剂、材料：黑色素细胞培养基、p75NTR的抗体、胎牛血清、二抗FITC、胰蛋白酶、DAPI、胶原酶Ⅳ号、Forskolin、牛脑垂体提取物、成纤维细胞生长因子、EGTA。

1.2方法

①神经的预处理：取成年约200～250g 的Wistar大鼠，在无菌条件下麻醉，剥离双侧20~25mm长度的坐骨神经。放到PBS缓冲液中，尽量剥除神经外膜，用剪刀将组织剪成2~4mm的神经段。把坐骨神经片段放入到培养基中2周以体外预变性。成纤维细胞可从神经组织爬出，培养基DMEM加入了10%(v/v)胎牛血清FBS与1%(W/V)青霉素/链霉素。同时，为了提高雪旺细胞的增值，加入2 M forskolin作为雪旺细胞特异性的有丝分裂原。

②神经消化分离处理 ：经过两周，将预处理的坐骨神经碎片，加入0.125%的胶原酶IV号与1.25 U/mL的中性蛋白酶混合酶各2mL，再放入37℃、5%CO2培养箱孵育20h[4]。之后在室温2000r/min离心3min弃上清液，得混合雪旺细胞与成纤维细胞。混悬转移到2g/mL多聚赖氨酸的培养皿中。24h之后，更换含有2 M Forskolin、10ng/mL FGF和5g/mL牛脑垂体提取物，阻止成纤维细胞的增值分裂。

③雪旺细胞提纯：5~6d之后，细胞铺培养皿底部70%左右。为得到大量雪旺细胞，用2mL不含Ca2+和Mg2+的PBS溶液和2mL 1 Mm EGTA冲洗。在显微镜观察3~4min，细胞收缩分离，漂浮起来的是雪旺细胞，收集悬液，2000r/min离心3min，弃上清，加入1mL DMEM培养基混悬，重复离心去上清，用DMEM培养基混悬，转移培养皿中，继续培养。

1.3雪旺细胞培养与鉴定

①雪旺细胞形态：显微镜下见，雪旺细胞呈胞体凸起，并发出两个长触角呈梭形或发出三个触角呈三角形；而成纤维细胞，呈较大扁平的不规则形态[5]。

②免疫荧光染色：雪旺细胞接种在多聚赖氨酸(15 g/mL)涂覆的盖玻片上，放入到4%多聚甲醛与PBS中，固定30min，再PBS冲洗。加入10%(v/v)山羊血清和1mg BSA/mL的PBS中1h。首先加入由3%(v/v)山羊血清和1mgBSA/mL PBS稀释的抗体p75NTR 2h或4℃过夜。拿出冲洗细胞加入二抗，羊抗兔IgG共轭荧光素异硫氰酸酯(FITC)在37℃ 45min。冲洗再加入DAPI， 2min后细胞核被染色，用荧光显微镜观察。

③流式细胞仪分析：收集的细胞直接流式细胞仪分析后直接染色，通过测量荧光强度的p75NTR阳性细胞的分数比例，得出雪旺细胞的百分比。胰蛋白酶消化后用细胞计数器计数后流式细胞仪检测，达到106个雪旺是细胞的纯度有意义。

2　结果

2.1原代培养和雪旺细胞增殖

见图1。离体坐骨神经组织经过两周预处理后图片,胶原酶和中性蛋白酶消化后平均得到(4.0±0.8)×106个细胞/皿。24h大量悬浮细胞贴壁生长，两种细胞形态完全不同。以扁平的不规则形态和一个卵圆形细胞核呈现的为成纤维细胞；雪旺细胞一般为体积小的、明亮的、两极的梭形或三极的三角形，有比较长的触须样形态，见图2。细胞的纯度为(64.1±0.7)%。换加入2 M Forskolin、10ng/mL FGF和5g/mL牛脑垂体蛋白提取物培养基之后，成纤维细胞的数量明显减少，见图3。对照组成纤维细胞比例高，未用做进一步研究。用EGTA处理后，见图4，大部分双极和三极的细胞收缩、分离、被悬浮释放；而扁平的不规则形态的细胞则没有发生这种变化。收集漂浮细胞，转移至另一新培养瓶中，继续培养。24h细胞贴壁后，图5。7d后，雪旺细胞纯度可达到(99.2±0.4)%。见图6～8，显示细胞免疫荧光染色，之后流式细胞仪检测，显示大于99%的细胞对p75NTR标记阳性，为雪旺细胞。

图1　预处理两周(×10)　　　图2　消化后培养24h(×10)　　　图3　换培养基后(×10)

图4　培养后用EGTA纯化过程(×10)　　　　图5　EGTA纯化后贴壁24h(×10)

图6　加入抗体后染色(×20)　　图7　细胞核染色(×20)　　　图8　合成后效果图(×20)

3　讨论

这项研究叙述了一个比较高效的提纯和获得大量雪旺细胞的实验程序。当与未经处理的神经相比[6]，体内和体外采用预变性处理而得到活性雪旺细胞是一种简单有效增加细胞产量的方法。当暴露于Forskolin两周预变性后雪旺细胞产量、纯度和细胞增值率增加，所以我们采用这个方法。这个新的研究方法涉及到加入EGTA试剂后，雪旺细胞和成纤维细胞分离的不同，雪旺细胞可以挛缩呈椭圆状以至分离漂浮，这要可以纯化雪旺细胞。这种方法的关键点在于一个合适的细胞外基质的应用，一个理想的基质可以让雪旺细胞和成纤维细胞差动分离。因此，在本研究中我们测试了不同浓度的层黏连蛋白或多聚赖氨酸作为细胞外基质。我们观察得到，使用2g/mL多聚赖氨酸，分离雪旺细胞与成纤维细胞效果更明显。其一，细胞接种密度过大，雪旺细胞与成纤维细胞重叠影响分离。本研究认为的密度为7.5×104个/cm2，这低于之前研究的雪旺细胞和成纤维细胞混合的密度。其二，细胞增殖不同，在第一个48h内，雪旺细胞增殖要比成纤维快，但72h后成纤维细胞会迅速的增值，把雪旺细胞覆盖。为了解决这个问题，我们要换加入抑制成纤维细胞增殖试剂的培养基。此外，用能分离雪旺细胞的EGTA试剂处理，成纤维细胞密度过大将影响分离效果。在细胞特征结合形态学观察，细胞纯度可以达到99%。根据文献差速贴壁分离和胶原酶处理等方法，通过实践没有达到这个纯度。总之，使用EGTA对两种细胞分离处理，是在短时间内，获得高纯度雪旺细胞的方法之一。为雪旺细胞的临床研究奠定了基础。

参考文献：

[1]张睿, 张军, 赵承斌. 激活态雪旺细胞对神经干细胞分化作用的研究[J]. 中国医药导报, 2014, (7): 19-22

[2]孙焕伟, 张铁慧, 由欣岩, 等. 不同浓度许旺细胞与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物修复损伤周围神经的比较[J]. 中国组织工程研究, 2014, (47): 7579-7584

[3]周翔. 雪旺细胞与异种骨支架的体外复合培养研究[D]. 第四军医大学, 2014

[4]李陈, 肖玉周. 施万细胞培养与纯化研究进展[J]. 医学综述, 2014, (08): 1371-1373

[5]严广斌, 卢永辉, 钱东阳, 等. 施万细胞从兔变性坐骨神经中的分离、纯化和培养[J]. 广东医学, 2013, (20): 3108-3110

[6]姜叶. 乳鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养的实验研究[D]. 青岛大学, 2014

中图分类号：R338.1

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2015)06-0050-02

(收稿日期：2015-06-08)