糖尿病大鼠结肠动力变化及其机制探讨

张惠洁，吴泉霞，赵劢，谭至柔，秦荔荣，黄雪

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)



糖尿病大鼠结肠动力变化及其机制探讨

张惠洁，吴泉霞，赵劢，谭至柔，秦荔荣，黄雪

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

摘要：目的观察糖尿病(DM)大鼠结肠动力的变化，并探讨其机制。方法将34只SD大鼠随机分为3组，观察组和模型组制作DM模型，观察组于造模6周后每天皮下注射甘精胰岛素8 U/kg，对照组和模型组均注射等量生理盐水。干预4周后处死各组大鼠，剖腹取出全部肠道测量肠道推进率，免疫组化法检测各组近端结肠Cajal间质细胞(ICC)、缝隙连接蛋白43(Cx43)，透射电镜观察近端结肠的超微结构。结果观察组肠道推进率高于模型组，模型组低于对照组，P均<0.05。结肠组织ICC及Cx43表达均为对照组高于观察组、观察组高于模型组，P均<0.05。观察组ICC数量、细胞间缝隙连接明显多于模型组,但少于对照组。结论DM大鼠存在结肠动力障碍，可能与结肠组织ICC数量减少、细胞间缝隙连接破坏及Cx43表达降低有关；甘精胰岛素可抑制上述改变，改善结肠动力。

关键词：糖尿病；结肠动力障碍；Cajal间质细胞；缝隙连接蛋白43

胃肠动力障碍是糖尿病(DM)常见的慢性并发症[1]，其机制目前尚不完全清楚。近年研究发现，DM胃肠动力障碍与Cajal间质细胞(ICC)的减少和细胞间通讯功能障碍有关。ICC 是胃肠道平滑肌细胞间的起搏细胞，可产生自发性慢波并介导神经递质传递。ICC之间及ICC与平滑肌细胞之间的信号传递由缝隙连接(GJ) 介导是细胞间信息通讯的主要通道。缝隙连接蛋白(Cx)是GJ 的基本构成部分，Cx43是目前发现的最重要的Cx。2014年3～8月，我们观察了DM大鼠结肠动力变化，并探讨其作用机制。现报告如下。

1材料与方法

1.1材料SPF级SD大鼠34只，体质量160～180 g，雌雄各半，由广西医科大学动物实验中心提供(许可证号：scxk桂2009-0002)。c-Kit兔多克隆抗体(sc-168，武汉博士德公司)；兔多克隆Cx43抗体(武汉博士德公司)；SP试剂盒(SP-9000，北京中杉金桥生物公司)；DAB显色试剂盒(ZLI-9031，北京中杉金桥生物公司)；链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)用0.1 mmol/L、pH 4.4柠檬酸缓冲液配制后备用；德国罗氏活力型血糖仪(配套试纸)；注射甘精胰岛素(诺和诺德中国制药有限公司)。

1.2动物分组及处理取24只SD大鼠采用一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg制作DM模型，测得血糖≥16.7 mmol/L且能稳定维持1 周以上者为造模成功。最终造模成功纳入19只，将其分为观察组10只和模型组9只，取10只正常SD大鼠为对照组。观察组于造模6周后每天皮下注射甘精胰岛素8 U/kg，模型组和对照组注射等量生理盐水，持续4 周。

1.3肠道推进率测定干预4周后禁食16 h，经口灌入0.01%的美蓝溶液2 mL，30 min后颈髓脱臼法处死大鼠；剖腹取出从幽门到直肠末端全部肠道，在无张力状态下测量肠道全长及美蓝溶液在肠道的推进距离，计算肠道推进率(肠道推进率=美蓝推进距离/肠道全长×100%)。因大鼠结肠较短，因此本研究以全肠肠道推进率代表结肠推进率。

1.4 结肠组织ICC、 Cx43表达测定采用免疫组化法。剪取各组大鼠近端结肠(距盲肠2 cm)组织长约0.5 cm，常规固定、包埋、切片，脱蜡；抗原修复、过氧化氢灭活、血清封闭，分别滴加c-Kit一抗(1∶50稀释)、Cx43一抗(1∶100稀释)各50 μL，4 ℃过夜；先后滴加生物素标记的二抗及辣根过氧化酶各50 μL，室温孵育15 min；DAB显色，复染，冲洗、封片，显微镜观察。结肠组织ICC主要分布于黏膜下环行肌层表面、环行肌层与纵行肌层之间、环行肌层和纵行肌层内，以环行肌层和肌间神经丛区域最明显；Cx43主要分布在环行肌与纵行肌之间和环行肌层外表面。以胞膜上或胞质内出现棕黄色片状或颗粒状物为阳性反应。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，计算各组累计光密度值(IOD)。

1.5结肠组织超微结构观察 取各组约1 cm近端结肠组织，戊二醛固定。经前固定、后固定、块染、脱水、浸渍后包埋成块，光学显微镜下半薄切片;用亚甲蓝染色定位，确定组织分层后，LKB-Ⅱ超薄切片机切片;保留环形肌、纵形肌及部分黏膜层，用日立H7650透射电子显微镜观察ICC细胞数目及GJ情况。

2结果

2.1各组肠道推进率比较观察组、模型组、对照组肠道推进率分别为64.68%±1.85%、54.51%±2.34%、71.15%±2.60%，观察组肠道推进率高于模型组、模型组低于对照组，P均<0.05。

2.2各组结肠组织ICC及 Cx43表达比较详见表1。

表1　各组结肠组织ICC及 Cx43表达比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

2.3各组结肠组织超微结构比较对照组ICC细胞形态数量较多，基膜完整，胞核大，呈圆形或卵圆形；细胞质较少，胞质和突起内含有丰富的细胞器，滑面内质网发达，粗面内质网数目较少，高尔基体发育良好，线粒体丰富，紧密排列在胞质里。细胞间存在大量紧密GJ。模型组ICC数量明显减少，基膜溶解，部分基膜与细胞膜分离，形成空泡；胞质广泛溶解，胞质内空泡数目较多，胞质内细胞器数量明显减少，线粒体肿胀、空泡样变，内质网扩张，粗面内质网部分脱颗粒；细胞间的GJ明显减少，尚存细胞间连接结构不清，连接松散。观察组ICC数目、GJ均多于模型组，但少于对照组。

3讨论

DM发病率逐年升高，且呈年轻化趋势[2]，胃肠动力障碍是其常见慢性并发症，而DM结肠动力障碍又是常见表现之一。DM结肠动力障碍临床特征为腹胀和便秘，病理生理特点为结肠张力和收缩力降低，蠕动减慢，排空延迟，严重影响患者的生活质量及口服降糖药的效果。目前，其病理生理学基础尚不完全清楚。

ICC是胃肠慢波的起搏细胞，具有产生慢波、传导慢波电位、介导神经递质传递等功能，在维持正常胃肠动力方面发挥着重要作用[3]。近年研究发现，多种胃肠动力障碍性疾病如贲门失弛缓症[4]、先天性巨结肠[5]、慢传输型便秘[6]等均存在ICC形态、分布及数量的异常，ICC数量减少可导致结肠起搏功能减弱，平滑肌产生异常的不规则慢波、收缩功能障碍、蠕动减少或不能产生有效的推进性收缩运动[7]。GJ又称通讯连接，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起重要调控作用[8]。Cx43是人类主要缝隙连接蛋白[9],其表达异常与多种疾病的发生有关[10，11]。研究发现，Cx43基因具有肿瘤抑制性，多种癌细胞中均存在Cx43的低表达[12]。Cx43与胃肠运动密切相关，Cx43广泛存在ICC之间、ICC与平滑肌细胞(SMC)之间及SMC与SMC之间，ICC、ICC与SMC可通过GJ形成三维网络结构和功能上的电偶联体，产生兴奋或抑制性反应[13]。本研究发现，各组结肠组织ICC、 Cx43表达均为对照组高于观察组，观察组高于模型组。说明细胞间连接通讯破坏，引起胃肠神经末梢-ICC-SMC之间的信息和物质传递障碍，电传导减弱；ICC作为结肠运动的起搏细胞和介导神经递质的功能显著下降，进一步导致肠道神经系统对SMC的调节减弱，从而引起结肠运动功能障碍。

研究发现,DM胃肠动力障碍时胰岛素分泌减少[14]，可导致DM相关ICC缺失，胰岛素可能通过促进胃肠SMC生长、抑制其凋亡、诱导其表达干细胞因子，对ICC起保护作用[15，16]。其可能作用机制为胰岛素通过PI3K/Akt和Ras/MAPK两条信号转导通路实现[17～19]。但其具体机制尚有待于进一步研究。

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收稿日期：(2015-09-01)

通信作者：谭至柔

基金项目：广西自然科学基金资助项目(2010GXNSFA013143)。

中图分类号：R574.4

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)46-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.009