青壮年期2型糖尿病肾病大鼠骨形态变化及机制探讨

张从艳，郑志远 ，修明文 ，刘维

(1中国石油中心医院，河北廊坊065000；2廊坊市人民医院；3天津医科大学总医院)



青壮年期2型糖尿病肾病大鼠骨形态变化及机制探讨

张从艳1，郑志远2，修明文2，刘维3

(1中国石油中心医院，河北廊坊065000；2廊坊市人民医院；3天津医科大学总医院)

摘要：目的观察青壮年期2型糖尿病肾病大鼠骨形态变化，并探讨其发生机制。方法将52只2月龄SD雄性大鼠随机分为观察组33只和对照组19只。观察组制备2型糖尿病肾病模型，造模成功后分别于5、6月龄时处死大鼠。分离各组左侧胫骨近端1/3行骨形态计量学分析，测量各组左侧股骨骨密度，留取血尿标本检测血钙、磷、碱性磷酸酶和24 h尿钙、磷。结果 镜下可见对照组骨小梁排列密集，厚度较宽，间距小。 观察组5月龄骨小梁排列稀疏，骨小梁厚度变窄，间距加宽；6月龄骨小梁排列更稀疏，厚度更窄，间距更宽。观察组骨小梁面积百分数(Tb.Ar)、骨小梁宽度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)均低于对照组，骨小梁数(Tb.N)多于对照组，P均<0.05；观察组5月龄Tb.Ar、Tb.Th、Tb.Sp均高于6月龄，Tb.N少于6月龄，P均<0.05。观察组5月龄、6月龄及对照组的骨密度分别为172.50±4.96、172.74±4.63、187.79±3.90，P均<0.05。观察组血碱性磷酸酶、尿钙水平均高于对照组，P<0.05。结论青壮年期2型糖尿病肾病大鼠骨小梁减少、骨密度下降，可能与血液中碱性磷酸酶、尿钙升高有关。

关键词：2型糖尿病；糖尿病肾病；骨小梁；骨密度；骨形态计量学

骨质疏松是以骨量减少及骨微结构退行性变为特征的一种全身性骨骼疾病，是一种代谢性骨病，老年人群发病率较高，女性发病率高于男性。近年研究发现，老年糖尿病肾病患者骨质疏松发生率明显高于健康人群。但是，关于青壮年糖尿病患者骨质疏松发生情况的报道少见。2014年3～11月，我们观察了青壮年期糖尿病肾病大鼠的骨形态变化，并探讨其发生机制，旨在为骨质疏松的预防提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料2月龄清洁级雄性SD大鼠52只，体质量200～250 g,由天津医科大学实验动物中心提供。VITALAB-micro半自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，Prodigy型DEXA骨密度仪(美国Lunar公司)，0.5%Villaneuva骨染色剂(美国BD公司)，POLYCUT硬质骨切片机(德国)。

1.2动物分组及模型建立将52只大鼠随机分为对照组19只和观察组33只，观察组采用单侧肾切除术+高糖高脂饮食饲养4周+一次性腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg方法制作2型糖尿病肾病模型，注射后1周测得尾尖随机血糖>16.7 mmol/L及24 h尿白蛋白显著升高则判为造模成功。对照组采用假手术+基础饲料饲养4周+0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液3 mL腹腔注射。观察组造模成功后继续采用高糖高脂饮食饲养，分别于大鼠5、6月龄时处死17、16只；对照组大鼠于饲养至5月龄时处死大鼠。处死各组大鼠前，留取24 h尿；均采用股动脉放血处死，留取血液标本，分离血清，-80 ℃保存备用；分离左侧胫骨近端1/3置于70%乙醇中固定；分离左侧股骨，用生理盐水浸透纱布包裹，-80 ℃保存。

1.3骨形态观察取左侧胫骨近端1/3标本，去除软组织，暴露骨髓腔；骨染色剂染色4 d，脱水脱脂,包埋标本;干燥1周后切成20 μm切片，光学树脂封胶片。将骨切片置于Olympus光学显微镜下，观察骨小梁排列情况。用Kontroniba2.0全自动图像处理系统测量干骺端骨松质的4个静态指标：骨小梁面积百分数(Tb.Ar)、骨小梁宽度(Tb.Th)、骨小梁数(Tb.N)及骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.4骨密度测定采用骨密度仪联合小动物测量软件测定各组股骨骨密度。

1.5血清钙、磷、碱性磷酸酶及尿钙、尿磷水平测定取24 h尿及血清，应用VITALAB-micro半自动生化分析仪，采用邻甲酚酞络合铜比色法检测血钙及尿钙水平，紫外终点法检测血磷及尿磷水平，连续监测法检测血碱性磷酸酶。

2结果

2.1各组骨组织形态学比较镜下可见对照组骨小梁排列密集，厚度较宽，间距小。 观察组5月龄骨小梁排列稀疏，骨小梁厚度变窄，间距加宽;6月龄骨小梁排列更稀疏，厚度更窄，间距更宽。两组Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比较见表1。

表1　两组Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与观察组5月龄比较，#P<0.05。

2.2各组骨密度比较观察组5月龄、6月龄及对照组的骨密度分别为172.50±4.96、172.74±4.63、187.79±3.90， 5月龄、6月龄骨密度均高于对照组，P均<0.05。

2.3各组血清钙、磷、碱性磷酸酶及尿钙、尿磷水平比较见表2。

表2　各组血尿钙、磷及血清碱性磷酸酶水平比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。 3讨论

骨密度是骨代谢关键指标之一，尤其在动物实验中，骨密度快速准确检测对骨代谢的判断有重要意义，可准确反映骨代谢情况[1,2]。大鼠的骨重建周期为30～40 d，本实验选择5月龄和6月龄分别处死大鼠，以保证实验结果的可靠性。本研究中，模型组5月龄处死者骨量明显低于对照组，骨显微结构有较大改变，小梁骨所占比例下降，排列稀疏不规整，厚度变窄，间隙增大。而正常大鼠一般10个月才能达到峰值骨量，糖尿病肾病大鼠骨代谢受损严重[3,4]。6月龄组较5月龄组，骨密度有所下降但无统计学意义，但骨显微结构有进一步变化，骨小梁比例下降，厚度变窄，间隙变宽。表明随糖尿病肾病病程进展，骨质恶化明显。

糖尿病肾病时机体常因高血糖、高血脂、低胰岛素血症、促炎因子释放、高渗性尿钙流失等因素引起骨代谢改变、骨密度降低、骨量丢失[5～8]。肾小管病变可导致1-α羟化酶功能受损[1,2]，1-25(OH)2D3严重缺乏，影响肠道钙磷吸收和肾小管对钙的重吸收，导致机体负钙平衡，为维持正常血钙浓度，骨吸收加速动员骨库钙储备，使骨量降低。本研究中各组间血钙磷水平比较无明显差异，观察组血碱性磷酸酶明显高于对照组，尿钙水平高于对照组。有研究发现肾脏病变时近曲肾小管大面积空泡变性、糖原累积，可导致1-25(OH)2D3严重缺乏[9,10]，出现高渗性利尿，钙盐大量丢失，肾小管重吸收钙功能受损，机体呈负钙平衡，为维持正常血钙，骨形成大幅增加，破骨活跃，导致碱性磷酸酶水平升高。

综上所述，青壮年期2型糖尿病肾病大鼠骨密度降低，骨量丢失明显，可能与尿钙及血清碱性磷酸酶水平升高有关。

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收稿日期：(2015-08-11)

中图分类号：R587.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)46-0028-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.010