等温滴定量热法在分子印迹技术中的应用

黄妍，张迎庆

(湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068)

等温滴定量热法在分子印迹技术中的应用

黄妍，张迎庆Δ

(湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068)

分子印迹技术是一种制备对特定分子有特异性结合能力聚合物的新兴技术，近年来受到广泛关注。本文即对等温滴定微量热法在分子印迹技术中的应用做一综述，介绍微量热法的基本原理、特点，以及其应用于评价分子印迹聚合物的印迹效果、筛选单体和交联剂、优化反应条件等方面的研究进展。

分子印迹；等温滴定微量热法；筛选；优化反应条件

近年来不断发展的分子印迹技术得到人们的普遍关注，并且其在制备、理论以及应用方面都取得了较大的进展。但即使如此，分子印迹技术仍存在着一些难点，例如，制备分子印迹聚合物时功能单体和交联剂的选择以及采用的聚合方法都具有一定的局限性，由于研究方法和手段较为单一，分子印迹过程和分子识别过程机理的探究还比较欠缺。等温滴定微量热法根据反应体系的热量变化测得的热力学参数，可以分析反应过程中的变化和反应性质，并且灵敏度高，对微小的热量变化同样非常敏感，因此该法不仅广泛应用于小分子、蛋白质等[1-4]生物分子间的相互作用，还可用于研究分子印迹聚合过程的中分子间相互作用，进而可以评价分子印迹聚合物的印迹效果。本文综述了近年来等温滴定微量法在分子印迹技术中的应用进展。

1 分子印迹技术概述

分子印迹技术(molecularly imprinting technology，MIT)是以某种分子为模板，制备对模板分子具有选择性识别并对其有结合能力的聚合物的技术，所制备的聚合物称为分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)。印迹过程模仿了抗原-抗体的反应机理，在印迹材料中引入特异性识别位点：模板分子与功能单体相互作用后在交联剂作用下发生聚合，形成聚合物，在一定条件下除去模板分子后，可得到MIPs。MIPs是一种高稳定性的聚合物，对高温、高压和较大的酸碱变化有一定的耐受性，且制备简单、成本低、不易被生物降解、可重复利用[5]，同时还具有在三维空间上与模板分子匹配的空穴和由功能单体形成的特定识别位点，专一性强，这使它成为识别元件的最佳选择[6]。因此，这类聚合物在分离提纯[7]、化学传感[8]、环境监测[9]、膜分离[10]等方面有着广阔的应用前景。

分子印迹聚合物的制备方法可以按照单体与模板分子结合方式的不同，分为共价法和非共价法2种基本方法。在共价印迹中，功能单体和模板分子通过共价键结合形成复合物，聚合后脱去模板分子。这种方法能在印迹聚合物中形成良好的模板分子的空间结构，但形成聚合的时间长，模板分子不易洗脱，难以达到热力学平衡，不适于快速识别[11]；在非共价印迹中，单体通过非共价作用如金属螯合作用、氢键、范德华力及疏水性相互作用等与模板分子相结合，不仅可以供给模板分子更多的相互作用，提高结合率，还可以减少干扰物对聚合物的非特异性结合[12]。

由于生物大分子体积庞大、结构和理化性质都比较复杂，含有更多的结合位点，所以对于生物大分子印迹聚合物，不仅要在合成过程中考虑生物大分子的特殊性，选择功能单体与交联剂及聚合的条件，确保生物大分子的构象完整和生物活性不被破坏，而且要考虑生物大分子表面众多的结合位点，可能会导致印迹聚合物产生较多的非特异性吸附的问题。同时生物大分子巨大的体积使聚合物上的模板分子难以洗脱，所以生物大分子印迹聚合物的制备要求比小分子聚合物更高。因此目前分子印迹技术在小分子印迹方面的应用较多，而在大分子印迹方面的应用还比较少。目前，生物大分子的印迹技术方法主要有包埋法[13]、表面印迹法[14-15]和抗原决定基法[16]。

分子印迹聚合物的表征和印迹效果的评价方法据应用领域的不同各不相同。常采用傅里叶红外光谱[17]、扫描电镜[18]或质谱、核磁共振[19]等对印迹聚合物结构进行表征。采用紫外光谱[20]和高效液相色谱[21]等方法，利用保留时间tR、结合常数Kb、分离因子α、分离度Rs、离解常数Ka、富集常数等，来测定分子印迹聚合物对模板的选择吸附能力。但是这些印迹效果评价方法对于相互作用较弱的印迹识别误差较大，且用于印迹识别行为研究时较为繁琐。

2 等温滴定量热技术原理及特点

任何变化都存在着热效应。等温滴定量热(isothermal titration calorimetry，ITC)技术是一种新颖有效的热分析技术，能对反应中的热效应进行精确的测定，并获得一系列准确的热力学参数，根据这些参数的变化可以分析反应过程。

2.1 等温滴定微量热法的基本原理 等温滴定微量热法采用功率补偿的原理，直接测量反应的热变化[22]。该方法先将量热池中的反应体系维持在恒温状态后再进行反应和监测。滴定前，仪器中的2个量热池——样品池和参比池处于相同的预设温度，2者通过绝热装置隔开。在恒定温度下，加样针以一定速度向样品池中滴加客体分子。当客体分子进入样品池后，因反应而产生的热量变化使体系的温度发生改变，从而导致样品池与参比池之间存在温度差。此时量热池中的热敏传感器将检测到的热量差异信号传递给功率补偿装置，该装置会对样品池进行热量补偿，使参比池的温度与样品池一致，即ΔT=0。随着滴定过程的进行，等温滴定微量热仪会记录随时间所提供的热量大小并通过计算机放大后输出。当样品池中反应物的结合位点被样品分子完全占据，热效应也随之逐渐减小，补偿功率值趋于平稳，表明滴定结束[23]。根据热量峰的曲线形状选择合适的模型进行数据拟合，处理后可得到反应平衡时的焓变(ΔH)，通过ΔH可计算出平衡常数、反应的自由能(ΔG)和熵变(ΔS)。公式如下[24]。

ΔG=-RTlnk

(1)

ΔS=(ΔH-ΔG)/T

(2)

2.2 等温滴定微量热法的特点 等温滴定量热技术是一种直接测量反应体系中放出或吸收热量的技术，具有高灵敏度、自动化、微量化的特点，检测灵敏度可达0.1 μW。它对被研究体系的溶剂性质等没有任何限制条件，具有非特异性，并且在测量中无需添加任何试剂，直接检测反应过程，不会引入干扰因素。研究者只需设置好实验参数，如温度、注射次数、注射量即可由计算机来连续准确地检测各种热效应，并通过量热曲线记录反应的变化过程。通过对体系中热量变化的测定可以得到精确的结合常数(K)、反应化学计量数(n)、熵(ΔS)、焓(ΔH)等有关分子间相互作用的完整信息。最后，在微量热实验结束后，被研究对象没有任何损坏,样品还可以做进一步的分析测试研究。

3 等温滴定微量热技术在分子印迹中的应用

等温滴定微量热技术可以直接表征分子间相互作用的热力学驱动力。由于其可测得的热变化极其微小并且灵敏，已经成为鉴定分子间弱相互作用不可缺少的实验手段。分子印迹的反应过程也会产生热量的变化，例如模板分子和配位体的键合以及客体分子和印迹聚合物的相互作用等，都可以采用等温滴定微量热法从反应热的角度进行分析研究，其应用领域主要有以下几方面。

3.1 等温滴定微量热技术用于印迹效果的评价 等温滴定微量热技术多用于测定分子印迹聚合物的印迹效果。根据实验热谱图，可以得出滴定终点和反应过程中的焓变，求出吉布斯函数来测定反应过程中的相互作用。

Lei等[25-26]以马来松香酯为交联剂，盐酸小檗碱为模板，甲基丙烯酸为功能单体用悬浮法制备了含有菲骨架的分子印迹聚合物。通过高效液相色谱检测分子印迹聚物的选择识别的特性，并用微量热法检测了吸附过程。经Scatchard分析，发现聚合物有2种不同的结合位点，结合常数分别为kd1=0.020 4 mol/L和kd1=0.050 7 mol/L，表现为吸附过程的热流量曲线出现一个吸热峰和2个相对薄弱的放热峰。实验结果表明这种分子印迹聚合物对盐酸小檗碱具有高亲和性和选择性。随后又制备了以延胡索乙素为模板的分子印迹聚合物和非印迹聚合物。采用扫描电镜和氮吸附和热分析进行研究，量热曲线表明印迹聚合物比非印迹聚合物对延胡索乙素的选择性高。

3.2 等温滴定微量热技术用于筛选单体和交联剂 通常，可用微量热法测定单体和模板分子之间的相互作用[10]。选用不同的单体和交联剂与模板分子结合，通过微量热法测定，根据相互作用热效应实验结果，可以筛选出合适的单体和交联剂。Lin等[27]用微接触印迹法制备高亲和性的蛋白质印迹聚合物膜,根据分子间相互作用释放的热量差异，通过微量热法探究与模板蛋白相互作用的最佳交联功能单体。微量热研究表明四甘醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)对溶菌酶为模板分子时结合的选择性最高，2种分子间相互作用释放的平衡热效应值ΔQ为(54.4±1.78)mJ，而核糖核酸酶A和肌红蛋白酶的交联单体选用聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯(PEG400DMA)较好，单体与模板分子之间相互作用平衡热效应值ΔQ分别为(76.5±7.15)mJ和(463.36±17.76)mJ。同时，根据功能单体与模板分子间相互结合实验结果，得到苯乙烯单体对溶菌酶和核酸酶有着最高的热效应值，而甲基丙烯酸甲酯(MMA)，相对其它功能单体，能与肌红蛋白酶有着更好地结合。

通过微量热法得到的一系列参数反映出的印迹效果还可以研究模板分子、单体和交联剂之间的最佳配比。Fish等[28]用等温滴定微量热法探究了辛可尼丁分子印迹聚合物中最佳的单体浓度。他们用甲基丙烯酸作为功能单体滴定辛可尼丁，结果表明，当单体与模板分子的摩尔比为4:1时，甲基丙烯酸与辛可尼丁的氢键结合所需的能量ΔHf最小，用这个比例合成的MIP表现出对辛可尼丁的选择性最好。这进一步说明在聚合过程中，单体与模板比例平衡有利于聚合过程中的氢键与模板相互作用。但要注意减少多余单体的使用以降低聚合物的非特异性。

Chen等[29]在用微接触印迹法制备肌酸激酶印迹分子中，从减少非特异性结合入手，对功能单体进行筛选。将微量热法与ELISA法相结合，最终选用PEG400DMA为交联剂，甲基丙烯酸做功能单体，并且当印迹材料上使用的肌酸激酶的量为2.05×10-10mol/cm2，交联剂与功能单体用量比为1:19时，制备得出的分子印迹聚合物具有最佳的识别效果。Hsu等[30]利用等温滴定微量热法来设计不同靶蛋白的分子印迹聚合物的构建。他们将苯乙烯作为单体，与PEG400DMA在不同比例下合成MIP。根据等温滴定微量热法得出，该聚合物重新结合核糖核酸酶A的反应多为放热反应，苯乙烯作为功能单体，与功能单体相比较，能使MIP对核糖核酸酶A具有更高的亲和性。并且在25 ℃下，苯乙烯与PEG400DMA的最佳体积比为20:100时，所得聚合物与模板蛋白结合放出的热量最大，可以得到MIP结合核糖核酸酶A的最大印迹效率。

由于传统分子印迹聚合物的亲和性较低，为改善这一缺陷，Zhang等[31]采用DNA适配体作为大分子单体来改进MIPs的性能。腺苷的DNA适配体被裂解成两半之后，将其中一条单链用荧光标记后使之聚合到分子印迹聚合物中。所得MIPs的亲和结合率是无适配体片段混合物的2倍。等温滴定微量热实验中，用腺苷滴定含有DNA单链片段的混合液时几乎没有检测到热量变化，而滴定MIPs时，产生的ΔH变化是裂解的DNA单链混合液的18倍。因此相较于含有裂解DNA片段的混合液，聚合了DNA单链的MIPs对与该DNA单链互补的腺苷更具亲和性，进一步将DNA裂解液中的单链片段缩短到6个核苷酸的长度时，所得MIPs对腺苷的结合效率更高。该研究为分子印迹制备提供了一个新方法，即在聚合中结合高亲和性的生物聚合物片段，这些片段为一些低成本的化学合成的单体，而得到基于DNA化学的具高亲和效率的印迹聚合物材料制备方法。

3.3 等温滴定微量热技术用于制备反应条件的优化 通过ITC实验，根据热谱曲线也可以优化聚合时间。Gang等[32]为研究生物大分子表面印迹中最佳印迹效率的薄膜厚度与模板分子的结构之间的相关性，使用不同分子量的糖蛋白：核糖核酸酶B、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化酶作为模板分子，将糖蛋白以共价键的形式固定到m-氨基苯硼酸修饰的SiO2或者Fe3O4粒子表面，并且用多巴胺使糖蛋白与印迹修饰表面交联聚合。根据聚合时间的不同，制备不同厚度纳米尺度的印迹薄膜。实验将每种糖蛋白印迹制备不同厚度的印迹膜，对其结合热谱曲线进行了研究。实验结果表明，无论在简单或是复杂的环境中，经优化后的糖蛋白分子印迹聚合物都可以识别模板分子。对具有最大结合量和印迹效果的印迹薄膜的研究结果显示，印迹薄膜的厚度与模板分子的大小呈正相关，得出印迹薄膜的厚度应据装载的模板分子的几何大小进行调整，并揭示在印迹聚合物的设计中模板分子的结构具有重大影响。Chen等[33]通过微量热法测定了除草剂2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)与其分子印迹聚合物之间相互作用焓变化和熵变化，来探究该相互作用的性质，确定模板分子与其分子印迹聚合物的亲和性。研究发现，当pH为6时，熵主要驱动力，在水环境中模板与聚合物之间多依靠氢键和静电作用相结合。

3.4 等温滴定微量热技术用于双模板分子印迹聚合物研究 在一定程度上，ITC技术对探索分子印迹聚合物空间结构方面也有帮助。John等[34]先以间氨基苯硼酸(APBA)为功能单体，过硫酸铵做引发剂，分别以溶菌酶和细胞色素C为模板分子，在玻璃片上制备了APBA印迹聚合薄膜。他们采用微量热技术，印迹薄膜对模板蛋白的亲和力由重吸附反应得到的结果来评估，通过得到最大的ΔH来优化印迹薄膜对模板蛋白的吸附量。研究发现，印迹薄膜对非模板蛋白的亲和性远小于模板蛋白。于是他们又以溶菌酶和细胞色素C的复合物为模板合成印迹聚合薄膜[35]，观察发现，重结合实验中，混合溶液中溶菌酶和细胞色素C的2者摩尔比为43%:57%时，与功能单体结合得到的印迹聚合物能得到最大ΔH，达到最大吸附效率。而所得印迹聚合物对单一模板蛋白呈现很低的识别效果，聚合物仅对2种蛋白混合物具有识别，表明不同蛋白质混合后进行印迹时，蛋白间相互作用产生了新的印迹位点，在APBA聚合物上形成了一种不同于2种蛋白质单独印迹时的空间结构。

4 展望

目前分子印迹技术的研究历史相对较短，分子印迹技术的系统研究较少，有关分子印迹过程的热力学和动力学等相关理论和报道还比较少。在MIPs识别、结合模板分子过程中，由于MIPs中存在与模板分子相匹配的空间结构和识别位点，这其中会涉及到分子间和分子内的诸多作用力，应用微量热法可以得到一系列热力学参数，直观反映出这些复杂体系中分子间相互作用力的大小，并为揭示其相互作用机理提供依据[36]，有助于进一步研究分子印迹过程中分子内和分子间，以及分子和聚合物之间作用的机制，从而制定合理的实验方法，优化实验条件，得到具有高印迹效率的聚合物。ITC需样量少，灵敏度高，反应速度快，并具有实时、动态、在线等优点，定量描述反应过程。随着科学技术的不断进步，相信等温滴定微量热技术将会在分子印迹领域中发挥更大的作用。

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(编校：苗加会)

Application of isothermal titration calorimetry in molecular imprinting technique

HUANG Yan, ZHANG Ying-qingΔ

(School of Food and Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Molecular imprinting technique is a novel technology for preparing polymers with specific binding properties tosome specific molecules, and

widely attention in recent years.The article that was reviewed the applications of microcalorimetry in the molecular imprinting technique.The basic principle of microcalorimetry,characteristics and its advanced applications on evaluating imprinting effects of the molecularly imprinted polymers,screening of the monomers and the cross-linking agents, optimizing reaction conditions etc. were introduced.

molecular imprinting; isothermal titration calorimetry; screening; optimizing reaction conditions

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.043

黄妍，女，硕士在读，研究方向：生物化工，E-mail:wuhanhuangyan@163.com；张迎庆，通信作者，女，博士，教授，研究方向：生物制药，E-mail:yingqingzhang@163.com。

O642.2

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