骨与关节结核的诊断研究进展

金阳辉 石仕元 赖 震

骨与关节结核的诊断研究进展

金阳辉 石仕元 赖 震

结核；骨与关节；诊断；研究进展

骨与关节结核是伴随人类历史最长的疾病之一，敏感、准确、快速、高效、简单、价廉的检测手段是防治骨与关节结核的关键。近年来，随着影像学、细菌学、免疫学和分子生物学等检查方法的不断发展、检测设备的不断更新以及新的检测手段的不断涌现，为骨与关节结核的早期诊断带来了希望，现就骨与关节结核的诊断研究进展综述如下。

1 影像学诊断

1.1 X线 X线片作为骨与关节结核的常规检查，具有价格低廉、操作简单、快速直观等优点。在骨与关节结核早期诊断上可以确定病变部位、程度、骨质变化、破坏程度及软组织内脓肿等[1]。在敏感性方面，X线表现比较差，发病初期X线上常显示不出异常的征象，而当X线上出现异常征象的时候，骨质的破坏程度一般都达到50%以上。对软组织与死骨的钙化X线检查也存在着一定的不足，如关节结核早期X线平片可无明显改变或仅有轻度骨质疏松和关节间隙增宽或变窄，后期才会出现骨纹理紊乱，骨质模糊不清呈毛玻璃样，继而出现骨质破坏、缺损和死骨及周围软组织肿胀、脓肿及窦道形成[2]。

1.2 计算机X线摄影（CT） CT具有高分辨率、高敏感性和强大的三维重建功能。可以很好显示病灶周围软组织的情况，克服了检查部位组织结构重叠的影响，并且可以根据需求调节扫描层的厚度。陈忠元龙等[3]报道显示CT在骨质破坏、死骨形成、冷脓肿的显示、软组织和脓肿内有无钙化、椎体附件的破坏情况以及硬膜囊有无受压等方面的显示均明显优于X线平片。在微小骨质破坏和钙化观察方面的优势也使其可以更清晰地显示病灶内部结构。

1.3 MRIMRI对骨与软组织分辨率高,敏感性强，具有多平面的成像能力，可以清晰显示病灶范围、软组织异常和硬膜受压程度。相比较于X线和CT，可以更容易显示椎体骨质破坏、椎间盘受累、椎管受累和椎旁脓肿，可在脊柱结核骨质破坏前期即可做出早期诊断，是观察早期椎体骨质破坏、椎管内侵犯和脊髓病变最敏感的诊断方法[4-5]。在对骨膜下型结核和脊椎旁寒性脓肿的大小，形状、范围以及对周围器官和组织推压的显示方面，MRI也较X线片和CT片有更大的优势。

2 细菌学诊断

2.1 涂片抗酸染色镜检

2.1.1 萋-尼式抗酸染色法 萋-尼式抗酸染色镜检法可以对骨或关节结核脓液标本中的抗酸杆菌做到快速的检测，是诊断骨与关节结核最为经典的检测方法，也是在全世界应用最为普遍的技术。其优点：简单、快速、价廉，送检当天就能出结果。缺点：敏感性低，特异性差，不能区分结核杆菌和非结核杆菌，对L型和颗粒性结核分支杆菌也不能检出[6]，并且送检标本的质量和镜检人员的技术水平都会对最后的检测结果造成极大的影响。

2.1.2 发光二级管（LED）荧光显微镜检测 近年来，结合了发光二级管和显微镜的发光二级管（LED）荧光显微镜检测技术逐渐应用于结核分枝杆菌的检测。由于其简单、价廉、灯泡寿命长、不需要暗室，同时具有较高的敏感性和特异性等方面的优势，使其有望逐步替代传统光学显微镜而在结核病实验室中推广应用[7]。

2.2 结核分支杆菌培养法

2.2.1 L-J固态培养法 L-J固态培养法阳性率高于涂片法，可以进行活菌和菌系的鉴定，同时还可以进行药敏试验。但由于结核分枝杆菌缓慢生长的习性，通常需要6～8周才能出结果，而且阳性率也只有30%～40%，同时无法区分结核分枝杆菌与不致病的非结核分支杆菌。其耗时长，阳性率低的问题，使其难以满足临床需求，正在逐渐被液体培养基快速培养系统所替代，而临床运用越来越少。

2.2.2 液体培养基快速培养系统 BACTECTM MGITTM960和BacT/ALERT3D快速培养仪系统对骨与关节结核患者的病灶标本进行MTB分离培养，仅需两周，是目前临床上较常用的液体培养基快速培养系统，在阳性率和培养时间上较传统的L-J固态培养法更敏感、更快速。金格勒等[8]研究显示应用BACTECTM MGITTM960快速培养仪系统进行结核分枝杆菌培养4周阳性率 34.78%，8周阳性率57.97%，适当延长培养时间可提高培养阳性率。但是即便是适当延长培养时间，依旧存在着敏感性差、耗时长的问题，再则部分骨与关节结核患者由于病变部位的原因，造成临床标本的不易获取或者所取得的临床标本中所含菌量比较少，这些均会导致敏感性进一步下降。

3 免疫学诊断

免疫学检查法是用结核分支杆菌的菌体成分制成抗原或抗体，检查患者血清中的结核抗体或抗原，具有标本来源方便、检查速度快、操作简单、敏感性和特异性均较好等特点[9]，是诊断骨与关节结核的重要辅助检查之一，对骨与关节结核的诊断有着较高的参考价值。

3.1 结核菌素皮肤试验（TST） 结核菌素（包括旧结核菌素OT、纯蛋白衍化物PDD）皮肤试验基于IV型变态反应原理，通过将结核菌素再次注入皮肤，观察48～72h内注射部位是否出现变态反应判断机体有无感染过结核杆菌。其简便的特性使其成为近一个世纪来用于MTB感染检测最为普遍的传统方法，但是存在观察结果耗时长，敏感性低的问题，且无法区分是由于结核分枝杆菌复合群感染引起的变态反应，还是由于非结核分支杆菌或卡介苗的接种引起的致敏所导致的低特异性。因此我国作为卡介苗普遍接种的国家,TST的敏感性和特异性将会受到极大的限制。

3.2 结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB） TSPOT.TB为近年来用于诊断骨与关节结核的一项新技术，由敏联免疫斑点试验进一步发展而来，主要用于检测外周血标本，具有较高的灵敏性和特异性。古甫丁等[10]报道，T-SPOT.TB在骨与关节结核诊断中的敏感性和特异性分别是84.5%和90.4%。秦世炳等[11]报道，在骨结核诊断方面，结核感染T细胞检查的灵敏性为94.2%，特异性为70.8%。机体的免疫状态不会影响T-SPOT.TB的敏感性[12]，对免疫低下或免疫抑制人群亦可使用，并且在特异性上不会受到卡介苗和大多数非结核分枝杆菌的影响。该方法检测的标本易于采集（血液检测），检测时间不长,24～48h就能出结果。但是也存在着一些局限性：（1）该方法操作步骤较多且繁琐、检测费用昂贵。（2）采集到的标本较易受到污染，且还需要进行后续处理。（3）需要尽早测试以避免细胞功能下降，从而影响结果的准确性。（4）由于检测的是血液标本，所以对于病灶的位置无法确定。

3.3 结核抗体检测法 结核抗体存在于各种体液标本中，目前常用的方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点免疫渗滤试验（DIGFA）、斑点免疫层析试验（DICA）、免疫印迹试验（Westem blot）和蛋白芯片技术。ELISA始于上个世纪70年代，该方法快速、简便，敏感性和特异性也较高，是目前研究最多、临床应用最广泛的血清学诊断方法。DIGFA是基于ELISA发展而来的固相免疫标记测定技术，较ELISA更为简便、快速，无需精密仪器，15min可出结果，检测的敏感性和特异性与ELISA相当，并可以单人份测定。DICA是基于DIGFA发展起来一种新技术，其只需一个试剂、一个步骤即可完成检测反应的优点引起来人们的极大关注。免疫印迹斑点法具有很高的特异性和敏感性，但因操作繁琐而在临床上较少应用。血清结核抗体检测法具有重复性好、简单快捷、费用低等优点，已成为结核病常用的辅助诊断手段之一[13]，尤其是对骨与关节结核等肺外结核的诊断和鉴别诊断具有重要的意义。

4 分子生物学诊断

结核分子生物学诊断是基于对结核杆菌基因进行检测的一种技术，可以直接对结核分枝杆菌的种系进行分类鉴定和药敏的检测，具有简便、快速、试剂稳定、高敏感性和特异性等优点。1989年Hance[14]最早报道用PCR技术检测结核分枝杆菌，开创了使用分子生物学技术基因诊断结核病的先河，到最近几年在国内外受到广泛关注的Xpert MTB/RIF技术的问世，结核的分子生物学诊断在近年来获得了快速的发展。

4.1 荧光定量PCR（FQ-PCR） 荧光定量PCR（FQPCR）是美国PE公司开发的一种新的核酸定量技术，是在常规PCR的基础上，加入荧光标记探针，再融合核酸扩增、DNA杂交及光谱技术。该技术的特点是在封闭状态下检测，避免了扩增产物污染所致的假阳性；光谱技术提高了灵敏度；荧光探针DNA杂交进一步提高了特异性[15-16]。并且相比于常规的PCR技术，不仅实现了从定性到定量的飞跃，而且特异性更强，重复性更好，自动化程度更高。

4.2 XpertMTB/RIF XpertMTB/RIF整合了基于定量PCR分子遗传检测所需的3个步骤（样品准备、扩增、检测），将待检样品放入到XpertMTB/RIF反应盒中，系统就会自动按照相应的程序运行，实时检测PCR运行情况，一旦PCR完成，Xpert MTB/RIF检测系统全自动化的软件就会判断出患者是否患有结核病，以及是否对利福平耐药[17]。因其简单，只需一个步骤，即可自动化完成；快速，只需90min即可完成结核病的诊断和利福平耐药的检测；安全，全程在密闭的仪器中完成，无需生物安全需求。同时具有高敏感性和特异性，李力韬等[18]报道，在培养阳性的脊柱结核临床标本中，Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为98.43%，在培养阳性、涂片阴性的标本中，结核分枝杆菌检测的敏感度为97.67%。贾文韫等[19]报道，Xpert MTB/RIF利用脓液标本检测骨关节结核患者结核分枝杆菌的敏感性为93.87%，特异性为96.87%，阳性预测值为97.87%，阴性预测值为91.17%，一致率为95.06%。这些优点使得XpertMTB/ RIF在结核病的诊断中被WHO誉为最具有革命性突破的诊断技术。要说其不完美之处或许就在于其相对昂贵的检测费用和仅能对利福平的耐药进行检测。

4.3 恒温扩增检测技术

4.3.1 RNA恒温扩增检测（SAT）SAT是基于RNA

恒温扩增技术和实时荧光检测技术发展起来的一种新型核酸检测技术。其最大的优点在于直接以结核分枝杆菌特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，而RNA仅在活菌中存在，结核分枝杆菌死亡和RNA降解，该方法可以作为区分死菌、活菌的依据及治疗效果的检测[20]；SAT可在15～30min将模板扩增10亿倍的高扩增效率也确保了检测的灵敏度，整个过程耗时1.5h展现了其检测周期短的优势；RNA在自然环境中的极易降解，不仅有效地解决了PCR技术在检测TB时导致的假阳性问题，而且大幅度提高检测结果的可靠性；同时SAT相对于其他的核酸扩增技术，其反应抑制物更少，更进一步降低了假阴性结果的出现。

4.3.2 环介导等温扩增法（LAMP） LAMP是Notomi等[21]于2000年发明的一种全新的核酸扩增方法，不仅具有PCR技术的全部优点，而且操作方法简单。LAMP直接扩增临床标本中的Mtb DNA，不需昂贵的核酸扩增仪和检测设备；检测速度快：等温扩增法的诊断效能几乎等同于罗氏培养法，但是其检出时间仅仅只需1h左右，大大降低诊断延误的时间和几率[22]；鉴定简便：在恒温下进行扩增反应，产生大量的扩增产物即焦磷酸镁为白色的沉淀，具有极高的特异性，通过肉眼观察或浊度仪检测沉淀度就能判断扩增与否。这些优点使得LAMP不仅可以用于设备精良的大医院或者实验室，而且也可以用于基层医疗卫生机构或现场的快速检测。

5 展 望

目前骨与关节结核的诊断方法很多，尤其是近年来细胞免疫学和分子生物学诊断技术的飞速发展为骨与关节结核的诊断带来了新的突破，但是基于其自身所存在的缺陷或不足，使其依然不能代替MTB的涂片和培养而成为骨与关节结核诊断的金标准。目前依然没有一种技术能单独、有效地诊断骨与关节结核。因此临床应了解各种诊断技术的优劣势所在，并将这些技术有机结合，在传统检测的基础上，辅以最新的检测手段综合分析，做出正确诊断，充分发挥诊断技术在骨与关节结核防治中急先锋的作用。

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（收稿：2015-06-03 修回：2015-07-23）

杭州市科委引导项目（No.2014YD14）

浙江中医药大学附属中西医结合医院骨科（杭州 310003）

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