外周血循环肿瘤细胞对前列腺癌预后判断价值的研究

张传杰，　梁　超，　孙长策，　许　洁，　陆怡超，　曹雪琛，　黄飞扬，　李　普，　秦　超



前列腺癌专题

外周血循环肿瘤细胞对前列腺癌预后判断价值的研究

张传杰，梁超，孙长策，许洁，陆怡超，曹雪琛，黄飞扬，李普，秦超

第一作者： 张传杰，男，本科在读，研究方向：泌尿、男生殖系肿瘤，E-mail：18351978361@163.com

【摘要】前列腺癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，居男性肿瘤特异性死亡率的第二位，且呈逐年上升趋势。相当一部分患者确诊时已失去手术治疗的最佳机会，这部分患者虽对内分泌治疗(去雄)有初效，但最终可发展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)。该类患者预后差，对治疗反应差异性大，中位生存时间数1～2年，且对治疗预后的评判也难以量化明确。近年来，循环肿瘤细胞(CTCs)检测计数，甲基化表型分析及标记物检测等研究对于肿瘤细胞迁移，预后评估，个体化治疗显现出重要意义。因此，作者就CTCs的总体概况及目前在前列腺癌中的临床应用进行总结，为CRPC的个体化治疗方向提供参考。

【关键词】前列腺癌；去势抵抗性前列腺癌；循环肿瘤细胞；检测；表观甲基化；肿瘤标志物

过去几年中，在转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration resistant prostate cancer,mCRPC)的治疗方面呈现了长足的进步，例如阿比特龙、恩杂鲁胺、卡巴他赛、镭-233等药物在延长mCRPC患者生存方面证明有效[1]。但由于缺乏亚群预后的精确判断方法，前列腺癌个体化和程序化治疗管理的发展受到了阻碍。前列腺特异抗原(PSA)由于较低的特异性和精确性，对于预后的估计也难尽如人意。近年来随着检测技术的发展，以及对其相互的整合和延伸，涌现出一些更具价值的新方法[2]。有研究发现，循环肿瘤细胞的检测分析在mCRPC预后方面有一定的前瞻价值[3]，这为临床肿瘤(包括前列腺癌)的治疗和转移机制的研究带来深远的影响。本文整理综述有关外周血循环肿瘤细胞及其对前列腺癌预后判断价值的研究，为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)的个体化治疗方向提供参考。

1CTCs介绍

早在1869年Ashworth就研究发现在癌症死亡患者的外周血液中可以提取到肿瘤类似细胞，并首次提出“循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)”的观点。循环肿瘤细胞(CTCs)是指由肿瘤原发灶或转移灶自发或被动的脱落、转移进入循环系统的肿瘤细胞。在这些细胞中，大部分由于免疫清除及自身周期而很快死亡，但也有少数的细胞相互聚集生长成癌栓，并在相应组织中发展为转移病灶。此外，在对肿瘤转移的研究过程中发现，肿瘤细胞脱落→进入外周循环→侵袭生长已然成为转移的关键步骤。所以，CTCs的检测很可能是及时反映肿瘤转移情况、判断病情进展的可靠指标。

近年来，CTCs在分子生物学、临床检测及应用研究等方面发展迅速，相继的科研文献也表明了CTCs在胃癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌的临床诊治方面的价值。随着检测技术的发展，表面标记、分子分型等分析水平的提高，很有可能普及CTCs的应用以成为有效的肿瘤标志物[4-5]。

2CTCs的检测及计数

2.1CTCs的检测方法由于对CTCs富集检测的障碍，使得CTCs的研究处于瓶颈。所以，近年来一大批检测技术及方法层出不穷。例如：CTCs芯片，微流控成像细胞计数，酶联免疫斑点法，多色活体流式细胞仪技术，Cellsearch系统等。上述这些最新的CTCs检测方法、标志物各异，优缺点也不尽相同。

目前，基于免疫磁性原理的富集技术——CellSearch系统，已被广泛应用。此系统方法主要包括阳性富集和阴性富集：首先，Ep-CAM标记磁珠对上皮细胞进行富集，经固定后，用4’，6-二脒基-2-苯基吲(DAPI)荧光染料、CD45抗体、胞内角蛋白抗体(CK-PE)进行分选，最终把具有肿瘤细胞形态学特点且DAPI(+)、CD45(-)、CK(-)PE(+)的细胞判定为CTCs。早在几年前，Aliard等[6]应用此技术对3组不同的人群(健康者、非恶性肿瘤患者、原发及转移性恶性肿瘤患者)检测其外周血中的CTCs。结果表明，在所有被检7.5 ml外周血液中，仅在恶性肿瘤患者中可富集分选出此细胞，且具有显著性差异。但此方法亦有局限性，易遗漏发生上皮间质变(EMT)的细胞，并具有较大的假阴性率。

基于相似的免疫原理，CTCs芯片是一种新颖的微流体控动力学的富集手段。其每一张硅片上均有包被Ep-CAM抗体的位点，可避免白细胞错误的结合干扰。当设定外周检测血标本以特定速度通过芯片时，Ep-CAM阳性CTCs便被固定下来。通过对CK、DAPI阳性选择和CD45阴性选择处理，再经显微镜便可对细胞定性[7]。然而，此方法尚未成熟，成本亦较高。

相比较免疫学原理，密度梯度离心法和膜滤过分离法便是基于形态学的分离集合方法。原理很简单，即CTCs细胞密度普遍低于其他正常血细胞，而直径则因为分化问题大于其他血细胞，所以可以通过物理方法富集。此方法简单易行，价格成本低，但不可避免地是缺乏特异性，因肿瘤细胞变异较大，且密度直径近似的血细胞可混杂干扰。

2.2CTCs计数在多样的检测中，CTCs计数可能较具有重要意义。早在之前，Danila等学者[4]在评估abiraterone治疗CRPC的Ⅱ期实验研究中，发现有34%和41%的患者在治疗过程中，CTC计数由先较差状态(CTC≥5个)过渡为有利状态(CTC<5个)[5]。与此同时，另一项研究表明，CTC计数水平无明显的固定界值，而仅仅作为预测患者生存率状况的一个参考指标[8]。在临床药物阿比特龙的应用过程中，统计发现，CTC计数结合LDH及其他组织标志物变化水平，对于患者生存相关性的分析要优于单一前列腺特异性抗原(PSA)的变化[9]。这些发现强化了CTC计数可能成为一个潜在的替代性生物标记来反映治疗效果和生存率。

3CTCs的表观及标记物分析

除了CTCs细胞计数在临床方面的应用，其分子检测、表观水平的分析也提高了其检测准确性和临床可信度。迄今为止，受CTCs分离富集技术的限制，CTCs甲基化表观水平的研究非常稀缺。其中，甲基化作为一种重要的表观修饰，参与诸多机制，影响了基因的转录、翻译、表达等过程，影响着肿瘤的发展与迁移。例如，在胃癌中，p15缺失或突变十分少见，但由于其CpG岛甲基化而导致其mRNA转录异常，这样就导致该基因失活，从而成为胃癌形成的关键因素[10]。在一些先驱性研究中，Chimonidou等[11-13]研究了来自乳腺癌患者血清中肿瘤细胞相关癌基因的甲基化水平，选定的基因包括胱抑素B(CST6)、BRMS1、SOX-17等。结果显示：CST6的表观沉默[14-15]、BRMS1[16]、SOX-17甲基化[17-18]均可影响其表达转录，进而下调抑癌效果，缩短总体生存时间。而在前列腺癌方面的研究，Friedlander等[19]利用mCRPC患者血清肿瘤细胞侵袭的特性，在未化疗前通过细胞黏附基质富集CTCs。此技术黏附的细胞可随后释放在特定的环境中培养，以备精确的计数及分子研究。通过甲基化阵列覆盖肿瘤细胞的27 000个CpG位点，研究者得出：来自mCRPC患者肿瘤细胞的平均甲基化水平高于良性前列腺组织。值得注意的是，他们早在之前对mCRPC患者组织1 361位点甲基化的实验研究[20]中就发现，有86%的位点在这些侵袭性的细胞中同样地甲基化，而且这些侵袭性肿瘤细胞的甲基化更多地出现在那些凋亡、血管生成相关的基因位点。这一探索性的全基因组分析预示着保留在CTCs一些表观水平的分子机制和原发性肿瘤的进展是密切相关的。除了基于患者体外的研究证据，来自Ogunwobi等[21]建立的小鼠肝细胞癌模型的CTCs数据也表明：肝细胞生长因子及其受体(c-Met)基因的启动子低甲基化，从而在CTCs中表现出相应基因产物的高表达。

当前，研究已不仅仅局限于表观甲基化方面，其他标记物的检测分析也逐渐开拓。早期临床研究发现，一些核酸物质，尤其是细胞游离DNA(cfDNA)在肿瘤患者血清中的浓度有所增高[22]，而且基因和表观水平研究也证实了此点。但由于cfDNA起源混杂，无法精确，且难以追踪到特定的肿瘤细胞群，所以逐渐淡化了其临床应用的可能。迄今，CTCs的分子研究多聚焦于基因组、转录组和蛋白质组学。例如，不久前，Miyamoto等[23]便研究探索了CTCs中雄激素受体(AR)是否可以提供前列腺癌治疗相关有效的信息。他们的前研究证实，AR作为核受体超家族转录因子之一，其信号通路的异常与前列腺癌的发生密切相关。此次研究采取免疫荧光法标记人前列腺癌细胞株(LNCaP)来判断AR信号通路激活的程度，标记显示PSA(+)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)(+)可定义为雄激素信号活跃。将该项标记应用于前列腺癌患者的CTCs,再通过免疫磁珠Ep-CAM富集技术可进行分析判断。最终发现，对于去雄治疗敏感的患者，其与AR信号通路的下调抑制有着很大联系。与此同时，发展为去雄抵抗性的患者，如果其AR信号通路活跃，对abiraterone类雄激素合成抑制剂的治疗反应较差。由此说明，此类药物不能够有效下调阻断雄激素受体，并可导致耐药及病情恶化[24]。所以，上述的这些初步研究结果均提示，CTCs系列的分子表型在临床疗效方面的监测价值，但相应标记的选取及实施的规范化仍需进一步的证实和完善。

4CTCs在mCRPC方面的应用进展

对于早期前列腺癌，内分泌治疗有一定疗效，但进展为激素非依赖性前列腺癌后的治疗效果变差。正如前面所述的分子标记研究，CTCs与内分泌治疗之间的关系已早有关注。如有一项研究利用CellSearch标准方法检测了80 例接受内分泌治疗的转移性前列腺癌患者外周血中的CTCs，结果表明，检出的CTCs数目≥5个/7.5 ml，相应患者中位生存时间为17个月；而CTCs<5个/7.5 ml，其对应的中位生存时间在32个月以上 (P<0.007)，表明CTCs是内分泌治疗预测的敏感指标[25]。随后有研究发现，CTCs计数在评估化疗效果、复发可能大小、生存时间等方面均比PSA敏感且更具价值[26]，但与PSA水平变化无明显相关性。目前，CTCs计数仍有一定限制，其特异性及普及性有待提高和完善。

最近，复旦大学附属肿瘤医院Chang等[27]收集了70例mCRPC患者和20例健康人的外周血标本，利用CellSearch方法完成CTC的计数，利用Taqman探针的Realtime-PCR方法完成对CTC的干细胞标记物检测。基于研究，上皮间充质变(EMT)已经共识为肿瘤细胞散布转移的重要机制过程，且表现活跃于CTCs中。特此，在这些外周血样中，研究人员检测了干细胞相关基因(ABCG2，PROM1及PSCA)和EMT相关基因(TWIST1及vimentin)，而后记录患者的总存活数(OS)及治疗方法。结果，类似于CTCs计数，相关干细胞基因阳性表达预示mCRPC患者预后不良(P=0.01)。但是，EMT的基因表达却无任何预后价值(P=0.78)。一项多元研究表明，血清白蛋白(P=0.04)、ECOG评分(P<0.01)、CTCs计数(P=0.02)、干细胞基因标记物检测(P=0.01)均是独立的预后判断因子[28]。此外，尽管有40例归类于良好CTCs计数的患者，但干细胞标记物检测为阳性，均预后不良(P<0.01)。相比较单项CTCs计数指标，一项结合了计数和标记物检测的预后模型则反映了预判价值的提高(一致性概率从0.716到0.889)。对于那些接受多西他赛联合强的松第一治疗的患者，干细胞标记物阳性患者往往无进展生存期(PFS)短。而联合计数，EMT基因标记物检测模型却无PSA-PFS及PSA反应率的相关改变。综上所述，干细胞标记物检测联合CTCs计数能大大提高CTCs的预后判断价值，但尚有待进一步开发和完善。

5前景及展望

随着近年研究的发展，CTCs计数作为前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌的预后评价指标[29-30]，以及CellSearchTMSystem在MBC患者生存时间预测的应用已被FDA批准。临床数据表明，在趋势抵抗性前列腺癌患者中，CTCs计数的增加，一般提示疾病的发展、转移灶的增加及复发时间的缩短。但目前尚不能标准化为临床治疗判断的标志，也尚未在临床广泛的验证和普及。在这方面技术上是最大的限制，普通精度的仪器很难在数以亿计的血细胞中发现为数不多的肿瘤细胞，并且将其与其他上皮来源的非肿瘤细胞区分开。技术上富集CTCs的障碍也使CTCs表观甲基化水平的研究陷入瓶颈。目前，尚无纯分离CTCs表观甲基化研究文章的发表。希望将来通过技术的创新发展，在临床治疗前进行CTCs检测或是标记物分析，建立有效参考值范围，并在治疗过程中监测，实现个性化治疗方案。从深层的角度对CTCs分选后进行分子生物学特性研究，寻找可靠的肿瘤分子靶标，建全检测的分子标记谱，不仅可以提高CTCs检测的特异性，也能预测肿瘤细胞分子模式，为肿瘤治疗提供药物靶标参考。除此之外，通过基因不同区段的测序，对比研究原发性肿瘤细胞与不同阶段CTCs细胞基因水平的差异，可以确定肿瘤发生过程中是否有关键基因表达模式的改变。总而言之，不同水平研究CTCs，完善其预后判断价值及其他生物学意义，体现了临床工作及患者个体化治疗的需要。

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基金项目：国家自然科学基金(81372757)；江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目(201510312009Z)

作者单位：210029江苏南京，南京医科大学第一附属医院泌尿外科(张传杰，梁超，李普，秦超)；南京医科大学第一临床医学院(张传杰，孙长策，许洁，陆怡超，曹雪琛，黄飞扬)

通讯作者：秦超，男，副主任医师，研究方向：泌尿、男生殖系肿瘤，E-mail：qinchao@njmu.edu.cn

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2016.02.006

文章编号：1674-4136(2016)02-0091-05

[收稿日期：2016-04-05][本文编辑：李筱蕾]