预防静脉桥再狭窄的基因治疗研究现状

张华锋 高荣

综述

预防静脉桥再狭窄的基因治疗研究现状

张华锋 高荣

基因治疗；内膜增生；动脉粥样硬化；静脉桥再狭窄

动脉粥样硬化导致的冠状动脉疾病是全世界疾病死亡的一个主要原因。对于轻度至中度或慢性稳定的冠状动脉疾病而言，药物疗法有助于控制症状并延缓疾病进展，但经皮介入治疗和冠状动脉旁路移植手术（coronary artery bypass graft，CABG）在急性或严重的情况下是必要的。虽然近年来经皮介入治疗有了快速的发展，但不可否认的是CABG仍然是非常有效的方法，并且有证据表明对某些患者来说是一种最佳的治疗[1，2]。由于大隐静脉取材方便且长度充足等原因，使其成为最常用的血管桥材料来源。有文献报道，在所有静脉移植中，自体隐静脉移植术达70%以上[3]。

术后1年有15%～20%的静脉桥血管发生再狭窄或闭塞，术后10年达50%以上[2-4]。近年来，手术技术的提高、抗血小板药物和他汀类药物等的应用已经有效地减少了静脉桥再狭窄及主要不良心血管事件的发生率。但从1968年CABG应用以来，整体静脉移植失败率一直保持相对恒定[5]，而基因治疗作为潜在的治疗方法得以发展。

1 静脉移植的病理生理学

阻断静脉的血液供应，将导致缺血和细胞缺氧，术后容易受到缺血再灌注（IR）损伤。CABG术后，移植静脉发生“动脉化”，突然增加的血管压力及剪切力加重了内皮细胞的损伤，在某些情况下甚至导致细胞死亡。这种血流动力学的改变导致细胞基因表达的改变，并且促进炎症反应和细胞增殖，进而导致血小板的黏附、活化和聚集，白细胞募集及体内凝血系统的激活，产生一系列级联反应。血管损伤后，局部生长因子和激素刺激血管壁平滑肌细胞表型发生改变。静脉移植术后24小时内，血管平滑肌细胞经历了静止、增殖、合成和运动等一系列过程；术后7天，平滑肌细胞迁移进入内膜并开始表达细胞外基质基因[6]。内膜增生（IH）被认为是静脉桥再狭窄的标志。

2 基因载体

2.1 非病毒载体

2.1.1 裸质粒、脱氧核苷酸（ODN）、小干扰RNA（siRNA） 上述各载体能有效转染内皮细胞和平滑肌细胞，影响转基因的表达。Santel等[7]证明，对小鼠内皮细胞siRNA进行荧光标记20分钟后就可在全身系统中观察到。除了针对静脉桥再狭窄的早期阶段，非病毒载体在兔静脉移植模型中用来观察术后8周的诱导转基因表达情况。SiRNA和shRNA在静脉壁内可以用来靶基因的沉默表达，ODN是基因治疗的独特方法。这些基因靶向工具在基因组中通常由具有转录因子结合位点的短双链DNA序列组成，并且在细胞增殖阶段诱导基因转录的终止。重要的是，ODN和siRNA的体外传递已被实验和临床证明是安全的[8]。

2.1.2 纳米颗粒 纳米粒子（NPs）是亚微米聚合物胶体粒子，可以影响基因的持续传递，并具有良好的安全性。持续基因传递在抑制SMC增殖方面是特别有帮助的。虽然目前尚无研究用聚合物纳米粒子防止静脉桥再狭窄的基因传递，但研究人员证实了平滑肌细胞和内皮细胞能高效吸收聚合物纳米粒子[9]。总之，纳米粒子作为一种防止静脉桥再狭窄的基因传递方法有其发展价值。

2.2 病毒载体

2.2.1 腺病毒载体 腺病毒（Ad）是无包膜的双链DNA病毒，腺病毒载体具有较大的装载能力，能有效地转染分裂和静止的细胞，并在感染后数小时内就可表达转基因。它们具有广泛的细胞嗜性和转基因表达，约60%的人对腺病毒抗体的反应是阳性[10]，因此，腺病毒在人类系统传递其感染效率将被保证。第一代腺病毒由于其大的基因组（约30 kb）和在感染细胞中病毒基因的共同表达使其免疫原性也相当大。体内腺病毒载体的基因表达通常在7天达到高峰，28天消失[11]。腺病毒介导的β-ARKct转染抑制移植静脉内膜增生的发展[12]。

2.2.2 腺相关病毒载体 腺相关病毒是细小病毒家族的单链DNA病毒。腺相关病毒载体（AAV）的几个特点表明，它是一种很有前途的基因转移载体，它比腺病毒更适合于血管基因的治疗[13]。AAV影响长期的基因表达（数月至数年），尤其是在对SMC增殖方面尤为显著。持续的AAV介导的转基因表达、SMC增殖和迁移的抑制可能有助于防止晚期移植失败，并在基因传递时提供被感染的靶细胞。重组腺病毒相关载体是删除所有病毒基因，因此相比腺病毒而言大大降低了免疫原性，并且在实验和临床中显示出了良好的安全性[14]。AdCMVCD在兔静外静脉实验中表明，其自杀基因系统对CABG术后再狭窄有明显的治疗作用[15]。

2.2.3 慢病毒载体 慢病毒是来自逆转录病毒家族。慢病毒载体能高效转染血管组织，具有低免疫原性，并产生持久的转基因表达[16]。然而，潜在的插入突变是一个重要的安全问题，从而降低了慢病毒载体用于人类的热情。另外，非整合载体已被开发，但它们的安全性和有效性还没有得到完全的肯定。

3 分子靶向治疗策略

3.1 内皮损伤和内皮血管保护因子损失 一氧化氮（NO）在舒张血管、调节血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板聚集和白细胞黏附方面发挥着重要的生理功能。冠心病的发生、发展与内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因密切相关，eNOS是NO合成的限速酶。Marsden等首先报道了这一基因，详细阐述了该基因的结构和染色体定位，并发现人类eNOS基因存在多态性[17]。用腺病毒介导的eNOS治疗大隐静脉证明其增加了NO的释放并提高了血管的功能。在同一组另一项研究对人取材的大隐静脉进行体外培养，并对内膜增生与对照组相比进行了组织学评估，表明用腺病毒介导的eNOS处理过的静脉段内膜增生明显减少[18]。在犬和高胆固醇血症兔的移植模型中将牛eNOS cDNA封装在日本凝血病毒（HVJ）中并行脂质转染，在术后4周观察到内膜增生明显减少[19]。王晓明等[20]的研究表明，取山羊颈静脉作血管桥，移植到颈动脉上，术后30天免疫组化染色，发现eNOS基因转移可以有效抑制移植血管新生内膜的增生，对预防移植血管的狭窄有一定作用。但由于eNOS基因多态性的存在，这也给临床进一步研究冠心病的治疗策略带来了些许难点。

PGI2由正常的内皮细胞产生，能抑制血小板聚集、白细胞黏附及平滑肌细胞增殖。环氧合酶-1（COX-1）是PGI2合成的限速酶。有实验表明，在猪的颈动脉血管移植模型上COX-1的腺病毒过度表达增加了PGI2的产生并防止动脉血栓形成。在完整的内皮细胞，由于移植物再灌注后活性氧的产生会使内皮功能受到影响，在这种情况下研究出了超氧阴离子（O2-），其与NO反应形成弱血管扩张剂过氧亚硝基阴离子（ONOO-）。超氧化物歧化酶（SOD）催化O2-在过氧化氢酶的作用下转化为过氧化氢（H2O2）。在小鼠缺血再灌注损伤模型中过氧化氢酶基因治疗能改善其肝功能，但尚未被应用到静脉桥再狭窄模型中[21]。

3.2 血栓形成 在术后早期血栓形成是导致移植静脉失败的主要原因，虽然抗凝可降低早期移植血栓形成的风险，但不能避免。此外，全身抗凝治疗有一定的副作用，主要是出血并发症，这在术后是特别危险的。抑制静脉移植血栓形成的基因治疗将绕过这些系统性的副作用。抗栓治疗的基因策略包括抑制凝血因子、抗凝因子的过度表达，或内皮细胞生物学功能的调节。两个主要目标是血栓调节蛋白（TM）和组织型纤溶酶原激活物（tPA）。阿司匹林在小鼠模型中局部应用减少了静脉移植物的血栓形成。在临床试验中阿司匹林的应用虽然术后1年减少了静脉桥再狭窄的概率，但其远期效果仍需进一步证实[22]。在移植术后，TM、tPA表达减少，然而tPA对内膜增生的作用尚不清楚。在兔动脉损伤模型，Ad-tPA促进了内膜增生，可能是由于TPA对ECM的降解[23]。相反，在兔移植静脉模型中，4周后Ad-tPA降低减少了内膜增生。这些结果也许可以用内膜增生在动脉和静脉中的发病机制不同来解释，还需要进一步的研究来确定在静脉桥移植模型中tPA的过度表达对内膜增生没有不利的影响。另外，在动脉损伤模型上，组织因子途径抑制物（TFPI）基因转移和截断PDGF-β受体基因用来防止血栓形成和抑制新生内膜形成[24]。

3.3 炎症 在移植术后1周，静脉壁内皮损伤部位血小板活化，启动炎症级联反应，促进SMC增殖、内膜增厚，加速动脉粥样硬化，进而使白细胞活化并迁移，活化的白细胞、内皮细胞、平滑肌细胞分泌大量的细胞因子和生长因子，促进炎症反应，包括IL-1、IL-6、MCP-1、IL-8及TNF-α。在大鼠静脉桥移植模型，术后4周巨噬细胞逐渐耗尽，MCP-1和TGF-β的表达减少，内膜厚度变薄，这导致了几种方法的产生来阻断巨噬细胞的聚集。MCP-1是其中之一。在大鼠静脉移植模型术后数小时内，MCP-1开始上调，在第1周达到高峰，并持续至少8周[25]。众多的炎性细胞因子和黏附分子的转录由NF-κB上调，压力介导的静脉桥管腔和外膜的转染和NF-κB诱导的ODN，在犬和高胆固醇血症兔模型中证明减少了内膜厚度及平滑肌细胞增殖[26]。

另一种方法是利用痘苗病毒蛋白35K来广泛抑制炎症反应。35K是一种可溶性蛋白，它可以与趋化因子CC结合，进而阻碍其与趋化因子受体的结合，并在体内外影响其生理效应的发挥。与喂食普通饲料的ApoE-/-小鼠相比，喂食高脂肪饮食的ApoE-/-小鼠静脉注射腺病毒编码的35K，可降低全身动脉粥样硬化，减少移植静脉血管壁的增厚和巨噬细胞浸润[27]。

3.4 平滑肌细胞增殖与迁移 平滑肌细胞是内膜病变的优势细胞。平滑肌细胞靶向基因治疗的目的是恢复细胞的静止。随着SMC激活，细胞外基质被基质金属蛋白酶（MMPs）降解，进而促进SMC增殖和迁移到内膜。George等[28]发现，在猪静脉移植模型中，基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-3的过度表达在短期（术后28天）和长期（3个月）都有效降低了内膜的增生。有文献表明，移植静脉吻合后，血管壁压力的增加上调成纤维细胞生长因子（FGF）和血小板衍生生长因子（PDGF），这两者对于SMC的有丝分裂和趋化都是有效的。Mann等[29]在兔颈静脉颈总动脉移植模型中针对SMC增殖，利用反义ODN来抑制细胞周期中调控基因细胞增殖核抗原（PCNA）和cdc2激酶的表达。许多有丝分裂原通过G蛋白耦联受体（GPCRs）介导SMC增殖。

PI3K可以被许多生长因子受体和G蛋白耦联受体所激活，针对PI3K通路的治疗效果在西罗莫司（雷帕霉素）洗脱支架的临床试验中已被证明，其可有效地抑制内膜增生和经皮冠状动脉介入术后再狭窄[30]。

4 小结

实验的成功并不代表在临床上能达到相同的效果，仍需更多的工作来研究人类静脉桥再狭窄的分子通路，否则一旦用于临床，这些问题导致的结果可能会令人失望。即使基因疗法治疗静脉桥再狭窄成功应用于临床，也不可能只针对单通道将所有患者治疗成功，针对不同的通路和细胞类型联合应用可能有协同作用。同样的，结合基因治疗与其他方法可能会比任何单一方法能得到更令人满意的结果。

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Research status of gene therapy in preventing restenosis of vein bridge

Gene therapy；Neointimal hyperplasia；Atherosclerosis；Vein graft restenosis

010050 内蒙古自治区呼和浩特市，内蒙古医科大学研究生学院（张华锋）；内蒙古医科大学附属医院心脏大血管外科（高荣）

高荣，E-mail：gaorong1002@sina.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．02．002

R543.6

A

1672-5301（2016）02-0101-05

2015-09-22）