不同提取方法对核桃壳色素的抗氧化性影响

易建华， 王留续， 董文宾， 杨　梅

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安　710021)



不同提取方法对核桃壳色素的抗氧化性影响

易建华， 王留续， 董文宾*， 杨梅

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安710021)

摘要：利用超声辅助，分别以水、乙醇为提取剂，在最优工艺条件下提取核桃壳色素。以维生素C为对照，分别采取4种方法(总还原力、羟基自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基)对不同方法提取的核桃壳色素进行抗氧化活性的研究.结果表明：水提色素和醇提色素均有一定的抗氧化活性，在总还原力、羟基自由基、DPPH自由基清除力上，醇提色素的抗氧化活性高于水提色素；两种色素对超氧阴离子自由基均没有清除能力.

关键词：核桃壳； 色素； 抗氧化； 自由基

0引言

核桃(walnut)又称胡桃，是陕西省的著名土特产之一.我国是核桃大国，资源丰富，由于对核桃的综合开发利用不够，只注重于核桃仁的利用，而忽略了核桃壳的开发.

目前，对废弃物核桃壳的研究利用很少，大部分仅仅局限在做成不同规格的核桃壳超细粉、高级活性炭[1]、木质素及碳分子筛[2,3]，生产高附加产值的产品几乎没有.

随着人们消费水平、健康意识的提高，消费者更倾向于天然产物，对化学合成产品的信任感降低[4].从核桃壳中提取的色素，具有较好的稳定性和一定的耐光性[5]，可以作为天然食品添加剂和抗氧化剂，使废弃核桃壳变废为宝，开发本地区废弃资源，提高经济价值，延长核桃加工产业链.

本实验以废弃核桃壳为原料提取核桃壳色素，对不同方法提取的色素进行体外抗氧化活性研究，为核桃壳色素作为天然抗氧化剂提供一定的理论支持.

1材料与方法

1.1　材料、仪器与设备

(1)材料：核桃壳,实验室废弃核桃壳，清洗,40 ℃下烘干,粉碎后过80目筛；试验用水,纯净水，陕西省玉冰泉饮品有限公司；LSA-21树脂,西安蓝晓科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚,分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁,分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；3、5-二硝基水杨酸,化学纯，中国医药(集团)上海化学试剂公司；H2O2,分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷,科昊生物工程有限公司；浓盐酸,西安圣亚实验设备有限公司；DPPH·自由基,优级纯，sigma公司.

(2)仪器与设备：超声波清洗器,KQ 5200E型，昆山市超声仪器有限公司；电子天平,BS 323型、BS 224S型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；旋转蒸发器,RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂；循环水式真空泵,SHZ-D (Ⅲ)型，巩义市予华仪器有限责任公司；可见分光光度计,WFJ 7200型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；冷冻干燥机,FA-1A-50，上海比朗仪器公司.

1.2　实验方法

1.2.1核桃壳色素的提取及初纯化

取处理好的粉碎成80目核桃壳粉末5 g,以料液比1∶10加入60%乙醇，在70 ℃下超声辅助提取(功率200 W, 频率40 kHz)2次，每次40 min，过滤，合并滤液，浓缩，经树脂LSA-21纯化，冷冻干燥得到醇提核桃壳色素粉末.取核桃壳粉5 g，料液比1∶20加入蒸馏水，在70 ℃下超声辅助提取(功率160 W，频率40 kHz)2次，每次40 min，以下同上，得到水提核桃壳色素粉末.冷藏备用.

1.2.2核桃壳色素的抗氧化性测定方法

(1)总还原力的测定

采用普鲁士蓝法，当溶液中存在还原性物质时，在酸性条件下，铁氰化钾能够被还原成亚铁氰化钾，与铁离子反应形成普鲁士蓝，在700 nm有最大吸收峰.一般情况下，待测样品的吸光值越大，其还原力越大，抗氧化性就越强[6].

根据李美利[7]的研究稍微改进，取0.5 mL不同浓度的样品于具塞试管中，加入0.60 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS缓冲液，1.50 mL的1.0%铁氰化钾溶液，漩涡震荡均匀，置于恒温水浴锅中，50 ℃，20 min，冷水快速冷却，加3 mL的10%三氯乙酸，混匀取上清液3 mL，加5 mL蒸馏水、1 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，静置10 min，在700 nm处测吸光度Ai.以1.50 mL蒸馏水代替铁氰化钾溶液，做空白组，测吸光度Aj.样品的总还原力即为A=Ai-Aj.VC作为对照品，总还原力即为Ax.

(2)羟基自由基的清除能力测定

过氧化氢与Fe2+反应生成·OH，加入具有清除能力的物质，能够与水杨酸竞争，使有色物质的生成量减少，有色物质在510 nm有最大吸收峰.通过·OH清除能力的大小可以判断待测样品的抗氧化能力[8].

对陈伟等[9]的测定方法稍微改动，取1 mL 10 mmol/L的硫酸亚铁溶液于具塞试管中，加入2 mL 0.03%的过氧化氢溶液，2 mL不同浓度的样品，混匀、静置10 min，加2 mL 5 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，在恒温水浴锅中，37 ℃，30 min，在510 nm处测吸光度Ai.加样品，不加水杨酸-乙醇溶液为样品空白组，排除样品本身颜色的干扰，测吸光度Aj；不加样品，加水杨酸-乙醇溶液为空白组，测吸光度A0.VC作为对照组来比较效果.

式中,Ai:样品组，加样品和水杨酸的吸光度；Aj：样品空白组，加样品，无水杨酸时色素的吸光度；A0：空白组，不加样品，有水杨酸时的色素吸光度.

(3)DPPH·清除能力测定

DPPH·自由基是一种稳定的自由基，在517 nm处有最大吸收峰，其N上的一个游离电子，使其乙醇溶液呈紫色.当加入抗氧化物质后，自由基被清除，溶液颜色发生显著变化，由紫色变为淡黄色或者无色[10].DPPH·的乙醇溶液的褪色程度与抗氧化剂的强弱呈正向关系，因此可以通过颜色褪去程度来判断物质的抗氧化能力.

根据王标诗[11]和李紫薇[12]等的研究稍微改动，取2 mL不同浓度的核桃壳色素于具塞试管中，与50 mg/L DPPH·溶液混匀，避光放置30 min，以相对应的溶剂为参比，在517 nm测吸光度Ai.取2 mL不同浓度的样品于具塞试管中，与2 mL无水乙醇混匀，避光放置30 min，以相对应的溶剂为参比，在517 nm测吸光度Aj.取2 mL DPPH·溶液于具塞试管中，与2 mL无水乙醇混匀，避光放置30 min，以无水乙醇为参比，在517 nm测吸光度A0.VC作为对照组，用来比较色素的抗氧化效果.

式中，Ai：样品组，2 mL样品+2 mL DPPH·溶液；Aj：样品空白组，2 mL样品+2 mL无水乙醇；A0：空白组，2 mL DPPH·溶液+2 mL无水乙醇.

(4)超氧阴离子自由基清除能力测定

邻苯三酚在碱性条件下能够迅速自动氧化，释放出超氧阴离子(O2-·)，生成的中间产物在420 nm有最大吸收波长.当加入具有抗氧化性的物质后，能够与O2-·发生反应，抑制邻苯三酚的自动氧化，使生成的有光吸收的中间产物减少[13].通过O2-·清除能力的大小可以判断待测样品的抗氧化效果.

根据何华等[14]的研究稍微改动，取4.5 mL的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)于具塞试管中，在30 ℃下恒温15 min，加1 mL不同浓度的样品，再加入0.5 mL的25.0 mmol/L邻苯三酚，混匀后30 ℃下恒温反应15 min，立即添加2~3滴8 mol/L HCl终止体系反应，以蒸馏水为参比，在420 nm测吸光值Ai.加样品，不加邻苯三酚为样品空白组，测吸光度Aj，用来排除样品自身颜色的干扰；不加样品，加邻苯三酚作为空白组，测吸光度A0.VC作为对照组，比较核桃壳色素的抗氧化效果.

式中,Ai：样品组，加样品和邻苯三酚；Aj：样品空白组，加样品，不加邻苯三酚；A0：空白组，不加样品，加邻苯三酚.

2结果与讨论

2.1　核桃壳色素的总还原力测定

核桃壳色素总还原能力的测定，如图1所示.

图1　核桃壳色素的总还原力

由图1可以看出，核桃壳色素浓度在0.4～1.2 mg/mL范围内，随着浓度的升高，吸光值也逐渐升高，即表明核桃壳色素的总还原力随着浓度的升高而增强.VC的总还原能力与其浓度也是呈正相关关系.图1同时表明，VC的抗氧化性最强，其次是醇提核桃壳色素，最后是水提核桃壳色素.

2.2　羟基自由基清除能力测定

羟基自由基(·OH)是氧化能力很强的自由基，可以通过电子转移，夺取氢原子和一系列的氧化反应，可以加速糖类、蛋白质、脂类的氧化[15].过多的·OH具有很大的危害性，清除多余的·OH具有重要的意义.实验发现，核桃壳色素对·OH具有很好的清除效果，如图2所示.

图2　核桃壳色素对·OH清除作用

从图2可以看出，醇提和水提核桃壳色素浓度在0.2～1.0 mg/mL范围内，随着浓度的升高，·OH清除能力逐渐增强.在1.0 mg/mL时，醇提色素和水提色素的·OH清除力分别能达到96.13%和95.60%，和VC的清除能力几乎相当.·OH清除能力整体效果为VC>醇提色素>水提色素.

2.3　DPPH·清除能力测定

由图3可知，VC、醇提和水提核桃壳色素三者对DPPH·的清除能力具有明显的差异.

图3　核桃壳色素对DPPH·清除作用

从图3可以看出，随着浓度的升高，三者对DPPH·的清除能力也随之增强.在0.01~0.05 mg/mL范围内，DPPH·的清除能力大小为VC>醇提色素>水提色素.在浓度为0.05 mg/mL时，醇提核桃壳色素对DPPH·的清除力能达到83.31%，而水提核桃壳色素仅有57.80%.因此在实际应用方面，醇提色素要比水提色素具有更好的利用价值.

2.4　超氧阴离子自由基清除能力测定

实验表明，浓度在0.2～1.0 mg/mL之间，VC的清除能力与其是正相关关系，但是醇提和水提核桃壳色素均对O2-·没有清除作用(数据略).实验结果同胡博路等[16]的实验结果是一致的.

3结论

实验结果表明，醇提和水提核桃壳色素均有一定的抗氧化能力.在总还原力、·OH清除和DPPH·清除能力上，醇提核桃壳色素均要比水提核桃壳色素效果好，尤其是在对DPPH·清除方面.醇提和水提核桃壳色素对O2-·均没有清除效果，则核桃壳色素的抗氧化能力可能主要通过对·OH的清除来实现的.本实验主要是对不同方法提取的核桃壳色素的抗氧化活性进行了初步的探

究，而对核桃壳色素的具体成分及其化学性质尚不明确，因此有待进一步研究.

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【责任编辑：蒋亚儒】

Effects of different extraction methods on antioxidant

activity of walnut shell pigments

YI Jian-hua， WANG Liu-xu， DONG Wen-bin*， YANG Mei

(School of Food and Biological Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China)

Abstract:Walnut shell pigments were extracted by water and ethanol with ultrasound-assistance under optimal conditions,respectively.Four methods (namely,total reducing power,hydroxyl free radical,DPPH free radical,superoxide anion radical) were used to investigate on the antioxidant activity of walnut shell pigments extracted by different methods and by taking VCas control.The results show that water extraction and ethanol extraction pigments have some antioxidant activity.Ethanol extracts have higher antioxidant activity than water extracts based on the total power,the hydroxyl radical scavenging,and DPPH radical scavenging;These pigments have no ability to scavenge superoxide anion radical.

Key words:walnut shell； pigments； antioxidant； radical

中图分类号：TS202.3

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2016)01-0114-04

通讯作者:董文宾(1951-)，男，陕西宝鸡人，教授，博士生导师，研究方向：天然产物化学，dongwb@sust.edu.cn

作者简介:易建华(1971-),女，河南信阳人，副教授,研究方向：油脂与蛋白质化学

基金项目：陕西省科技厅农业科技攻关计划项目(2014K01-10-04)