胶体金在临床检验诊断中的研究进展

李慧敏　综述，　傅启华，　王　静　审校

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科，上海 200127)

胶体金在临床检验诊断中的研究进展

李慧敏综述，傅启华，王静审校

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科，上海 200127)

摘要：胶体金是一种广泛应用于纳米诊断的纳米材料，具有较大的比表面积，独特的物理特征，良好的生物相容性和化学稳定性。对胶体金进行特定的修饰可赋予其新的功能。本文主要对其在临床检验诊断中的研究进展作一综述。

关键词：胶体金；实验诊断；纳米材料

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)01-0076-04R446.61

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.019

Abstract:Gold nanoparticle is a type of nanomaterials, which is widely used in nanodiagnosis, and exhibits high surface-to-volume ratio, unique physical properties, excellent biocompatibility and chemical stability. Gold nanoparticle may easily be functionalized by modification with special molecules. In this review, we mainly focus on the recent advances of gold nanoparticle research in clinical laboratory diagnosis.

基金项目：上海交通大学“医工交叉基金”重点项目(YG2012ZD03)

作者简介：李慧敏，女，1988年生，硕士，主要从事分子诊断研究。

通讯作者：王静，联系电话：021-38625569。

收稿日期：(2014-02-20)

The research progress of gold nanoparticle in clinical laboratory diagnosisLIHuimin,FUQihua,WANGJing.(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiChildren′sMedicalCenter,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Key words: Gold nanoparticle; Laboratory diagnosis; Nanomaterial

胶体金(gold nanoparticle)又称为胶体纳米金，具有较大的比表面积，独特的光学、导电、导热等物理特征以及良好的生物相容性。独特的依赖其直径大小的光学特征以及在生物流体中的惰性和稳定性使胶体金逐渐成为纳米诊断中最稳定的材料[1]。通过选择合适的合成方法即可调节由其大小和形状决定的理化特性。通过在胶体金上连接巯基化DNA或蛋白质可赋予胶体金新的功能。胶体金所拥有的各种特性使其得以与不同的实验方法相结合，进而广泛应用于临床检验诊断。本文对其在3个方面的研究进展作一综述。

一、胶体金在免疫层析试纸条(immunochromatographic strip,ICS)法中的应用

胶体金在水溶液中溶解呈红色胶体状，在诊断实验中胶体金聚集红色更加明显，且这种红色肉眼即可鉴别。胶体金免疫标记技术正是基于胶体金的上述特性，将其作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术，是继酶免疫标记、荧光免疫标记、同位素免疫标记三大标记技术之后迅速发展起来的新型免疫技术。其标记技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，且检测不依赖昂贵的激光检测仪器，只需要普通光学仪器，甚至肉眼即可鉴别。胶体金ICS法生物传感器正是运用了胶体金免疫标记技术而产生的[1-2]。胶体金与ICS的结合取得了很大的成就并且已成功应用于临床检测。通过与科研所需要的特定抗体或商业化途径购买的试剂相结合，可以适应不同的实验需求。一次性的测试条方便携带，所需费用低，能快速诊断来源于临床、环境、食物等样本中的生物分子，并取得可靠的检测结果。

传统的ICS包括样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸收垫。金标垫上涂覆有抗体-胶体金结合物，可结合样本中的靶抗原，组成抗原-抗体-胶体金复合物。这种复合物移动到硝酸纤维素膜上后被针对靶抗原的二抗捕获，导致指示线出现红色，而检测区的另一条线上涂覆有抗IgG抗体，阴性和阳性的样本在此处均出现红色而作为对照线。近年来，该技术已进行了多种改进，如CHING等[3]对ICS设计了双检测线用于肉毒梭菌神经毒素(botulinum neurotoxin, BoNT)的检测。BoNT具有强大的神经毒性，通过抑制乙酰胆碱的释放导致中毒者瘫痪甚至死亡。其共有7个血清型，即BoNT/A~G，80%的中毒反应由包括BoNT/A和BoNT/B在内的4个血清型所导致[4]。在检测区分别涂覆抗BoNT/A单克隆抗体-胶体金复合物和抗BoNT/B单克隆抗体-胶体金复合物，可以分别并同时检测最低5 ng/mL的BoNT/A和10 ng/mL的BoNT/B。改进后的方法操作简便，敏感性高，不需要特定的仪器和实验操作人员，且能同时分辨2种血清型的神经毒素。

二、胶体金在比色法中的应用

一般情况下，胶体金(15 nm)溶解时成红色胶体状，在520 nm出现最大吸收波长，而聚集时呈现蓝紫色，且最大吸收波长发生偏移。通过吸附核酸序列、抗体等分子，胶体金得以与比色分析法结合，为临床诊断提供快速、简便的检测方法。胶体金拥有较大的比表面积，能够提高蛋白质、核酸或其它生物分子的固载量，使电流信号响应增强，提高传感器的敏感性。在过去的几十年中，以胶体金为基础的生物传感器被成功地应用于核酸[5]、蛋白质[6]、凝血因子[7]和病毒核酸序列的检测(如丙型肝炎病毒核酸序列的检测[8])，且这些生物传感器均具有较高的敏感性、特异性以及费用低等优点。因此越来越多的科研人员开始关注于其作为生物传感器在分子识别和核酸检测方面的应用。单链DNA对带负电荷的胶体金有很好的亲和力，其与胶体金的结合可以抵抗盐溶液对胶体金的聚集作用。胶体金对单链DNA的吸附作用取决于单链DNA的长度和反应温度，较短的单链DNA和较高的反应温度促进胶体金对单链DNA的吸附[9]。由于单链DNA具有易于折叠和解螺旋的特性，其暴露的碱基很容易通过范德华力吸附在胶体金上。其碱基上的氮原子可以将自身的负电荷传递给胶体金，增加胶体金所携带的负电荷和其之间的电荷排斥力，抑制其在盐溶液中的聚集。DENG等[10]以炭疽杆菌核酸序列为模板，设计合适的引物，通过不对称聚合酶链反应(asymmetric polymerase chain reaction, As-PCR)，扩增出不同长度的单链DNA(116nt、242nt、345nt、508nt)，将这些长度不同的单链DNA分别包被胶体金，结果表明这些单链DNA与胶体金结合后均能抵抗盐溶液对胶体金的聚集作用，使胶体金呈现红色。该文献第1次报道了长片段DNA与胶体金的结合，且这些不同长度的PCR产物包括了我们日常实验中常用到的片段长度，说明这种方法也同时可用于其他病原体的检测。

越来越多的科研人员根据胶体金的上述特性发展了不同的检测方法。GILL等[11]通过依赖解旋酶的恒温扩增(thermophilic helicase-dependent isothermal amplification，tHDA)对幽门螺杆菌的ureC基因进行扩增，同时设计一对分别与扩增产物两端互补的探针，将探针与胶体金结合并溶解在盐溶液中，此时该溶液呈现红色，且在520 nm处有最大吸收波长。将PCR扩增产物加入到上述溶液中，因探针与 PCR扩增所获得的核酸序列两端互补而结合在该序列两端，克服胶体金之间的相互排斥作用，使胶体金发生聚集，胶体金溶液由红色变为蓝紫色，且通过比色法分析发现最大吸收波长发生偏移。该方法具有一定的敏感性(可检测最低10 CFU/mL的幽门螺杆菌)，适用于检测核酸序列较长的基因。精液中果糖的含量反映精囊的功能，浓度过低可导致不育症。RAJ等[12]将3-氨基苯硼酸和L-谷氨酸-三氯酯修饰在胶体金表面，待测样本中的果糖可以与上述2种物质结合导致胶体金聚集，该方法操作简便，检测结果肉眼即可判断，为临床患者提供了极大的方便。透明质酸酶被看作是膀胱癌在尿液中的肿瘤标志物，NOSSIER等[13]将带有多聚阴离子的透明质酸和经处理后带有正电荷的胶体金混合孵育，正负电荷之间的相互吸引导致胶体金的聚集，待检样本中含有的透明质酸酶可以把透明质酸降解为小的片段，阻止透明质酸对胶体金的吸附聚集作用。通过该方法可以定量检测尿液中透明质酸酶的活性，为疑似膀胱癌患者提供有效的无创性检测。

通过上述这些科研人员的尝试，我们可以发现，胶体金应用于临床检测已不再局限于通过与核酸、蛋白的结合来实现，胶体金本身的特性决定了其广泛的应用范围。可以根据不同的检测需求，灵活设计出不同的实验方案。

三、胶体金在荧光共振能量转移(fluorescent resonance energy transfer,FRET)及分子信标中的应用

FRET是基于荧光基团供体和荧光基团受体间偶极子-偶极子耦合作用的非辐射方式的能量传递现象。FRET生物传感器广泛应用于各种生物分子的检测，如检测蛋白酶活力[14]等。因AuNPs具有高效淬灭活性和稳定的光学特性而被广泛应用于FRET。具有生物相容性的胶体金可以通过一个通用平台，为以超敏荧光为基础的探针提供较高的淬灭活性且具有被靶分子特异性识别的特性[15]。具有代表性的是其在分子信标中的应用，见图1。分子信标是一种在5′和3′末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的AuNPs紧紧靠近，荧光基团(供体)受激发后产生的光子被AuNPs(受体)淬灭，因而不会产生荧光[16]。

注：A为用于检测目的片段的分子信标，其中黑色的环状单链DNA和目的片段互补,红色单链DNA分别连接荧光集团和作为淬灭集团的AuNPs;B为目的片段;C为分子信标和目的片段结合，荧光集团和AuNPs分离，淬灭作用解除，发出荧光

图1分子信标检测目的核酸片段

近年来，随着纳米材料的广泛使用，该技术也在原有的基础上获得了改进，使其更好地服务于临床诊断和科学研究。如SONG等[17]将15 nm的胶体金作为受体，胶体金直径的扩大使其表面可以同时交联3种不同的特异寡核苷酸探针以识别特定核酸序列(定性)，且3种不同的特异寡核苷酸探针分别被3种不同颜色的荧光染料标记(定量)，这样胶体金上的荧光光谱就能够显示样本中目标序列的有无和多少，进而可以检测到3种不同的生物分子，如肿瘤标志物。该方法的实现得益于胶体金较高的、基本上能淬灭所有荧光染料的淬灭活性，而不必去考虑优化胶体金和不同的荧光染料配对时的条件。同时，由于探针的茎环结构存在构象限制，使该方法即使对单一错配的序列也有着较高的序列特异性。

胶体金-蛋白质纳米探针也被广泛应用于FRET，胶体金和蛋白质之间的连接主要依靠暴露在蛋白质表面的-SH[18]和-NH2集团对胶体金的吸附、固定作用，以及蛋白质和胶体金之间的物理吸附作用[19]。通过胶体金和蛋白质的结合，DENG等[20]设计出一段可以被丝氨酸蛋白酶水解的肽链来连接分子信标中的供体和受体。丝氨酸蛋白酶是一种Ⅱ型跨膜蛋白，高表达于多种肿瘤细胞表面，对肿瘤细胞的早期增殖发挥调节作用。待测样本中的丝氨酸蛋白酶通过水解肽链，使荧光基团与胶体金分离，淬灭作用被解除，荧光基团发出荧光。这些对分子信标技术的改善说明了胶体金和分子信标技术的结合在临床检验诊断方面有着很大的发展空间。

四、展望

胶体金拥有广泛的表面功能和生物结合能力以及独特的物理特性，使其成功地应用于物理和化学多种领域。胶体金较高的比表面积，在多重检测中所展现的高度敏感性和特异性，使其成为非常具有应用前景的纳米材料。可调整的合成方法和几乎没有限制的理化功能基团，使其成为医学诊断和治疗中最热门的纳米材料[21]。胶体金ICS是一种成功的应用于临床检验诊断的技术，特别适合于广大基层医院进行大批量、时间紧的检测和大面积普查等。

然而，胶体金本身的性质包括其表面特性及直径大小对实验结果的影响，标记到胶体金表面的各种生物分子探针的稳定性、活性、特异性以及某些实验中需要用到的高分辨率检测仪器却在一定程度上限制了胶体金在临床检验诊断中的推广和应用。因此，需要更多研究人员的共同努力，在胶体金的表面修饰、生物分子标记及生化反应条件、相应的检测仪器等方面进一步改进，使胶体金真正应用到临床检测。

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(本文编辑：姜敏)