黑果枸杞抗衰老作用研究

田　磊，蒋宝平，樊晓峰

黑果枸杞抗衰老作用研究

田磊1，蒋宝平2，樊晓峰2*

[摘要]目的观察黑果枸杞对D-半乳糖诱导的小鼠衰老模型的学习记忆力及抗氧化能力的影响。方法注射5% D-半乳糖制备小鼠衰老模型，灌胃给予黑果枸杞6周后，水迷宫法测定模型小鼠的空间学习记忆能力，试剂盒法测定脑中丙二醛(MDA)、过氧化脂质(LPO)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力，以及血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、MDA含量及SOD活力。结果黑果枸杞能缩短衰老模型小鼠在水迷宫的逃避潜伏期、游泳总路程、近台区停留时间、远台区停留时间、远台区游泳路程，增加衰老小鼠平均游泳速度及近台区的游泳路程；降低模型小鼠血清中MDA含量，升高血清中GSH-Px含量和SOD活力；降低模型小鼠脑中MDA、LPO含量，升高脑中SOD活力。结论黑果枸杞能改善衰老小鼠学习记忆能力，提高机体的抗氧化能力，具有一定的延缓衰老的作用。

[关键词]黑果枸杞；抗衰老；抗氧化；D-半乳糖

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of Lycium ruthenicum Murr.on the learning,memory and antioxidant ability of aging mice induced by D-galactose.MethodsAging model was induced by subcutaneously injecting mice with D-galactose.At 6 weeks after administration of aqueous extract of Lycium ruthenicum Murr.,the water maze was used to determine the function of learning and memory,the analytic kit was used to measure the activity of superoxide dismutase (SOD)，the contents of malondialdehyde (MDA) and lipid peroxidation (LPO) in brain of mice,as well as the activity of SOD,the contents of MDA and glutathione peroxidase (GSH-Px) in serum of mice.ResultsLycium ruthenicum Murr.could reduce the escape latency,swimming total path,shorten the time in the near station,significantly shorten the time and swimming path in the distant station area to stay,increase the residence swimming path in the area close to the table and the average swimming speed of aging model mice in a water maze.Besides,it could reduce MDA content and increase GSH-Px content and SOD activity in serum,increase SOD activity and reduce LPO and MDA contents in brain (P<0.05,P<0.01).ConclusionLycium ruthenicum Murr.has anti-aging effect on aging model mice,and the mechanism may be related to improving learning and memory and enhancing antioxidant ability in aging mice.

Study on anti-aging effect ofLyciumruthenicumMurr.TIAN Lei1,JIANG Bao-ping2,FAN Xiao-feng2*(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210029,China;2.Nanjing University of TCM,Nanjing 210023,China)

Key words：LyciumruthenicumMurr.;Anti-aging;Antioxidant;D-galactose

0引言

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.，蒙名：乔诺英-哈尔马格、藏药名：旁玛)为茄科枸杞属多年生灌木植物，是我国西北地区的一种野生植物，分布范围较广，其味甘、性平，果实除富含多糖、黄酮、类黄酮、微量元素等多种营养成分[1-2]外，还含有丰富的色素—天然原花青素。原花青素是最有效的天然水溶性自由基清除剂。已有研究表明，黑果枸杞可滋补肝肾、益精明目，适用于腰膝酸软；同时黑果枸杞还可以降低胆固醇，兴奋大脑神经，增强免疫功能，防治癌症，抗衰老等[3]。本文主要观察采自青海柴达木的黑果枸杞对衰老动物学习记忆能力及抗氧化的作用，为阐明野生黑果枸杞抗衰老的作用机理及后期的药物开发提供一定实验依据。

1实验材料

1.1药品及试剂黑果枸杞果实，黑色颗粒，产自青海省柴达木，试验时取25 g加100 mL矿泉水浸泡 6 h后过滤离心取上清液(紫色)用于实验。

1.2实验动物ICR小鼠，体重18~22 g，清洁级。扬州大学比较医学中心提供，合格证号：SCXK(苏)2012-0004。

1.3试剂生理盐水：南京小营药业集团有限公司，批号：12012121202；矿泉水：康师傅矿泉水，南京顶津食品有限公司，批号：20131207；D-半乳糖：美国Sigma公司，G0625；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化脂质(LPO)、丙二醛(MDA)试剂盒：南京建成生物研究所提供，批号：20131122、20131121、20131126、20131122。

1.4仪器TGL-16G离心机：上海安亭科学仪器厂；天平：Sartorius B71250，赛多利斯科学仪器有限公司；酶标仪：spectra Max 190，美国MD公司；Morris水迷宫及鼠通用Morris迷宫分析系统：淮北正华生物仪器设备有限公司。

2实验方法

2.1动物分组、造模及给药取ICR小鼠100只，雌雄各半，适应性饲养1周后随机分为对照组、模型组、黑果枸杞低剂量组(简称“低剂量组”)、黑果枸杞中剂量组(简称“中剂量组”)、黑果枸杞高剂量组(简称“高剂量组”)。模型组及低、中、高剂量组均按500 mg/kg[4]的剂量颈背部皮下注射5% D-半乳糖，连续注射6周，以制备小鼠衰老模型，对照组颈背部皮下注射等容量的生理盐水。造模同时，各剂量组开始灌胃给药。低、中、高剂量组分别灌胃给予不同剂量(1.25、2.50、5.00 g/kg)黑果枸杞水提物，同样连续灌胃6周，对照组和模型组灌胃给予等容量矿泉水。

2.2对衰老小鼠学习记忆能力的影响给药6周后，用Morris水迷宫对小鼠的空间学习记忆能力进行测定。Morris水迷宫由直径120 cm、高 40 cm的圆柱形水池、摄像机、监视器及图像釆集卡等系列记录显示系统组成。其内部被分为4个大小相等的象限，在其中的一个象限中央放置1个安全平台，此平台位置一旦被确定将在整个行为学测试中保持不变，平台低于水面1 cm，水温控制在(22±1) ℃，摄像机位于水池的正上方，便于记录小鼠在池中的游泳轨迹，用找到平台所需的时间(逃避潜伏期)表示小鼠的学习记忆能力。正式测试前，需每天训练2次，60 s/次，共6次，从不同点将试验小鼠面向池壁放入水迷宫中，若小鼠 60 s 未找到平台，将其拿到平台上并停留20 s。正式试验记录小鼠在水迷宫的逃避潜伏期t、游泳总路程m、平均游泳速度v、在第一区(近台区)停留时间t和路程m、在第四区(远台区)停留时间t和路程m，并统计计算结果。

2.3对衰老小鼠脑组织中LPO、MDA、SOD含量的影响游泳实验结束后，立即将各组小鼠眼眶取血(3 000 r/min离心取血清)后处死，并在冰面上迅速取出大脑，制成 10%的脑组织匀浆，用试剂盒测定血清中的GSH-Px、SOD、MDA值，脑组织中的SOD、LPO、MDA值。

3结果

3.1对衰老小鼠学习记忆能力的影响见表1。

表1　对衰老小鼠学习记忆能力的影响(n=10)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表1可见，D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠在水迷宫的逃避潜伏期、游泳总路程、近台区停留时间、远台区停留时间、远台区游泳路程均明显延长，近台区游泳路程缩短，平均游泳速度降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，表明衰老模型复制成功。与模型小鼠比较，黑果枸杞低剂量衰老小鼠远台区游泳路程缩短(P<0.05)；中剂量组衰老小鼠在水迷宫的逃避潜伏期、游泳总路程、近台区停留时间、远台区停留时间、远台区游泳路程缩短，近台区游泳路程增加，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；高剂量组衰老小鼠在水迷宫的逃避潜伏期、游泳总路程、近台区停留时间、远台区停留时间、远台区游泳路程缩短，平均游泳速度及近台区的游泳路程增加，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

3.2对衰老小鼠脑组织中LPO、MDA含量和SOD活力的影响与正常小鼠比较，D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠脑组织中SOD活力显著下降，LPO、MDA含量显著增加(P<0.01)。与模型小鼠比较，中、高剂量组衰老小鼠脑组织中LPO、MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)；高剂量组衰老小鼠脑组织中SOD活力升高(P<0.01)。见表2。

表2　各组小鼠脑组织LPO、MDA含量和

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.3对衰老小鼠血清中GSH-Px、MDA含量和SOD活力的影响与正常小鼠比较，D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠血清中GSH-Px含量和SOD活力显著下降(P<0.05，P<0.01)，MDA含量显著增加(P<0.01)。与模型小鼠比较，中、高剂量组衰老小鼠血清中MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)，血清GSH-Px含量和SOD活力升高(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表3　各组小鼠血清GSH-Px、MDA含量和

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

4讨论

衰老是生命的必经阶段，是机体的分子、细胞、器官功能发生退行性变化的生理、病理过程。自由基学说认为，体内自由基攻击生命大分子，导致细胞和组织受损，是机体衰老的主要原因[5]。目前，实验研究常用D-半乳糖诱发衰老模型，经造模后的动物会出现学习记忆能力下降，自由基产生增加，抗氧化物酶活性降低[6]，与16~24月龄衰老鼠相似。一定时间内连续给予D-半乳糖会使机体细胞内的半乳糖浓度增高，生成的半乳糖醇含量也会随之增加，导致机体在代谢过程中产生大量的自由基，进而导致细胞及功能障碍[6]，从而加速机体衰老过程。

自由基(也称游离基，包括O2-、H2O2、OH-等)能引起细胞生物膜上的脂质过氧化形成LPO。MDA是过氧化脂质代谢的终产物之一[7]，是衡量机体组织自由基代谢的敏感指标。LPO、MDA含量高低反映了机体组织细胞的脂质过氧化程度和自由基的产生情况。机体在产生自由基的同时，也产生抵抗自由基的抗氧化物质，以使机体能够清除自由基，防止自由基对组织和细胞造成损伤，即机体氧化和抗氧化系统。研究表明，机体氧化和抗氧化系统平衡失调而导致的自由基过量产生与衰老密切相关[8-9]。SOD和GSH-Px是机体重要的自由基清除剂[10]。SOD广泛存在于生物体的各种组织中，能促使超氧阴离子自由基变为过氧化氢和氧分子而被清除[11]，也能降低自由基代谢产物MDA的生成，使机体细胞和组织免受损害，故SOD活力的高低可反映机体清除氧自由基的能力。GSH-Px主要存在于细胞内，能特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应，在SOD的协同作用下，将自由基H2O2还原成水，迅速清除自由基；GSH-Px还可降解氢过氧化物和减少脂质过氧化物的生成，从而保护细胞膜免受损伤，稳定细胞膜结构和功能，有研究表明，GSH-Px随衰老过程活性逐渐下降[12-14]。因此，机体的氧化损伤与体内LPO、MDA及GSH-Px、SOD有很大的关联[15-16]。

黑果枸杞可药食两用，果实中含有的大量糖、黄酮等物质可对人体起到保健作用；其所含色素着色力强，且无毒性，可替代人工色素。现阶段对黑果枸杞药用和经济价值的研究较欠缺，客观原因是由于对其功效认识不到位，重视程度不高，对其应用特性研究不足。本实验主要从抗氧化、抗衰老的角度来研究黑果枸杞，结果表明，黑果枸杞能够对抗D-半乳糖引起的衰老模型小鼠的学习记忆力的衰退，降低衰老模型小鼠体内LPO、MDA含量，升高GSH-Px含量及SOD活力。说明黑果枸杞具有一定的抗衰老作用，其作用与增强学习记忆能力、减少机体自由基的产生、提高机体的抗氧化能力相关，为黑果枸杞的开发及产业化提供了一定的依据。

参考文献：

[1]王航宇,邓峰美,刘金荣,等.黑枸杞无机元素分析[J].中药材,2002,25(4):267.

[2]矫晓丽,迟晓峰,董琦,等.柴达木野生黑果枸杞营养成分分析[J].氨基酸和生物资源,2011,33(3):60-62.

[3]林丽,张裴斯,晋玲,等.黑果枸杞的研究进展[J].中国药房,2013,24(17):4493-4497.

[4]Ghanbari S,Yonessi M,Mohammadirad A,et al.Effects of IMOD(tm) and Angipars(tm) on mouse D-galactose-induced model of aging [J].Daru,2012,20(1):68.

[5]刘足云,王笑峰.衰老现象:生命科学的探究[J].科学,2013,65(3):26-31.

[6]秦红兵,杨朝晔,范忆江,等.D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的建立与评价[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(7):1275-1278.

[7]Avramovic N,Dragutinovic V,Krstic D,et al.The effects of omega 3 fatty acid supplementation on brain tissue oxidative status in aged wistar rats[J].Hippokratia,2012,16(3):241-245.

[8]Chen Y,Miao Y,Huang L,et al.Antioxidant activities of saponins extracted from Radix Trichosanthis:an in vivo and in vitro evaluation[J].BMC Complement Altern Med,2014,14:86.

[9]Li YN,Guo Y,Xi MM,et al.Saponins from aralia taibaiensis attenuate D-galactose-induced aging in rats by activating FOXO3a and Nrf2 pathways[J].Oxid Med Cell Longev,2014,2014:320513.

[10]Mittal R,Mittal N,Hota D,et al.Antioxidant effect of isoflavones:A randomized,double-blind,placebo controlled study in oophorectomized women[J].Int J Appl Basic Med Res,2014,4(1):28-33.

[11]Kumar V,Anwar F,Ahmed D,et al.Paederia foetida Linn.leaf extract:an antihyperlipidemic,antihyperglycaemic and antioxidant activity[J].BMC Complement Altern Med,2014,14:76.

[12]张玲,王晓闻.欧李仁多肽抗氧化作用的研究[J].中国食品学报,2012,12(7):36-41.

[13]卢海庆,李俊,刘成军,等.鲎血中超氧化物歧化酶对 D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化作用的研究[J].中国药理学通报,2012,28(12):1733-1736.

[14]Siqueira IR,Fochesatto C,De Andrade A,et al.Total antioxidant capacity is impaired in different structures from aged rat brain[J].Dev Neurosci,2005,23(8):663-671.

[15]LI J,Wang YX.Effect of different methods of hypoxic exercise training on free radical oxidation and antioxidant enzyme activity in the rat brain[J].Biomed Rep,2013,1(6):925-929.

[16]Yetuk G,Pandir D,Bas H.Protective role of catechin and quercetin in sodium benzoate-induced lipid peroxidation and the antioxidant system in human erythrocytes in vitro[J].Scientific World Journal,2014,2014:874824.