百里醌通过抑制氧化应激信号通路减轻肝缺血再灌注损伤

陈志则，夏中元，孟庆涛

百里醌通过抑制氧化应激信号通路减轻肝缺血再灌注损伤

陈志则，夏中元，孟庆涛

[摘要]目的探讨百里醌对肝缺血再灌注损伤的影响及其机制。方法建立小鼠肝缺血再灌注损伤模型。30只C57小鼠随机分为3组，每组10只，分别为假手术组、缺血/再灌注损伤组(IRI组)和百里醌预处理组(百里醌组)。IRI组、百里醌组小鼠肝缺血90 min再灌注4 h时采血和收集肝脏标本，分别生化检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量，以及肝组织中活性氧自由基(ROS)、丙二醛(MDA)含量，过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，观察肝组织的病理形态。结果与假手术组比较，IRI组ALT、AST、ROS、MDA含量提高，而CAT、GPx、SOD活性降低，病理改变加重。与IRI组比较，百里醌组ALT、AST、ROS、MDA含量降低，而CAT、GPx、SOD活性提高，病理改变减轻。结论百里醌能通过抑制氧化应激减轻肝缺血再灌注损伤。

[关键词]百里醌；肝缺血再灌注损伤；氧化应激

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect and mechanisms of thymoquinone on the hepatic ischemia reperfusion injury.MethodsThe mice of hepatic ischemia reperfusion injury model was established.30 C57 mice were randomly allocated to three groups,Sham group,hepatic ischemia reperfusion injury group (IRI group),thymoquinone precondition group (thymoquinone group).The blood supply of mice was blocked for 1.5 h,and the reperfusion lasted for 4 h.The expression of ALT and AST in the serum,the expression of ROS,MDA and the activation of CAT,GPx and SOD in the hepatic tissue and the pathology of liver tissues were examined.ResultsCompared to sham group,the expression of ALT,AST,ROS,MDA and the pathology of liver tissues in IRI group increased significantly,while the activation of CAT,GPx and SOD significantly decreased.Compared with IRI group,the expression of ALT,AST,ROS and MDA and the pathology of liver tissues in thymoquinone group significantly decreased,while the activation of CAT,GPx and SOD significantly increased.ConclusionThymoquinone could decrease the hepatic ischemia reperfusion injury by suppressing oxidative stress.

收稿日期：2015-04-29

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201510006

Thymoquinone protected hepatic ischemia reperfusion injury by suppressing oxidative stressCHEN Zhi-ze,XIA Zhong-yuan,MENG Qing-tao (Department of Anesthesiology,Wuhan University People′s Hospital,Wuhan 443003,China)

Key words：Thymoquinone;Hepatic ischemia reperfusion injury;Oxidative stress

0引言

肝缺血再灌注损伤是肝脏血供中断后，重新恢复血流导致肝脏损伤加重的临床危重症，常继发休克与肝移植等。最近研究发现，氧化应激在肝缺血再灌注损伤中起重要作用[1-2]。百里醌(Thymoquinone)在临床常用于治疗哮喘、湿疹、痢疾、头痛等[3-4]，具有抗氧化应激的活性，而氧化应激是肝脏缺血再灌注损伤的重要发病机制[5-8]。本研究构建缺血再灌注损伤小鼠模型，探讨百里醌对肝缺血再灌注损伤的作用及其对氧化应激的影响。

1材料与方法

1.1试剂百里醌(哈森：上海)，无水乙醇(Sigma：美国)，3%戊巴比妥钠(桥星，上海)，HE试剂由湖北省人民医院病理实验室配制。显微镜(Olympus BX51)及成像系统(HITMAS-30)均为医院病理科实验室临床病理组提供，百里醌用无水乙醇溶剂并配制成浓度为1 mol/L 的储存液，-20 ℃冰箱保存。

1.2实验动物SPF 级雄性C57小鼠30只，体重20~25 g，购自武汉大学实验动物中心，饲养于湖北省人民医院实验动物实验中心，设施使用证明号：014098。适应性喂养1周后，状态良好，小鼠随机分为假手术组、肝脏缺血再灌注损伤组(IRI组)和百里醌预处理组(百里醌组)，每组10只。百里醌组术前1 h给予百里醌50 mL/kg腹腔注射，剂量参考文献[6]；假手术组和IRI组术前给予等浓度生理盐水腹腔注射(50 mL/kg)。假手术组给予假手术，IRI组和百里醌组给予肝脏缺血再灌注手术。肝脏缺血再灌注手术方式：戊巴比妥钠麻醉状态下，开腹，腹正中切口，分离暴露肝门部，剪断左中肝叶各韧带，游离左、 中肝叶的胆管及门静脉、 肝动脉分支。用无创伤血管夹夹闭肝左外叶、肝中叶的门静脉及肝动脉分支，导致70%肝脏缺血[9]。阻断后可见被血供阻断区肝叶颜色由鲜红色变为暗红色，提示肝脏缺血成功，缺血90 min后松夹再灌4 h形成肝缺血再灌注模型。假手术组操作同上，但不夹闭血管。再灌注4 h后处死小鼠，收集血清和肝脏标本。实验中，动物状态较好，苏醒较快，无死亡动物，术后给予正常饮食饮水。

1.3ELISA检测血清中ALT和 AST表达水平按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测血清中ALT和AST表达水平。

1.4肝脏病理检测肝脏组织采用10%多聚甲醛固定，常规脱水浸蜡(Thermo Fisher)，石蜡包埋，4 μm切片，脱蜡透明后由病理科实验室HE染色。病理评分：没有损伤为0分；轻微损伤、胞浆空泡变性和局灶性细胞核固缩为1分；中度至重度损伤、具有广泛的核固缩为2分；出血和中性粒细胞浸润解体严重坏死为3分。

1.5肝组织ROS含量的测定活性氧自由基试剂盒测定ROS，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.6测定肝组织匀浆中MDA的含量和CAT、GPx、SOD的活性将剩余肝脏组织制备组织匀浆，硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的含量，测定肺组织中CAT、GPx和SOD的活性，具体步骤按试剂盒说明书进行。

2结果

2.1三组肝功能比较IRI组ALT、AST高于假手术组、百里醌组，见表1。

表1　三组ALT、AST比较(U/L)

注：与IRI组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2三组肝脏病理改变见图1、图2。由图1可见，假手术组肝脏形态肝小叶结构完整，无肿胀、出血、坏死、炎症细胞浸润；IRI组肝小叶广泛破坏，广泛肝细胞变形、坏死、肿胀、出血和中性粒细胞浸润；百里醌组与IRI组相比，肝小叶结构破坏，肝细胞变形、坏死、肿胀、出血，中性粒细胞浸润明显减少，其病理改变明显减轻。

图1　三组肝脏病理改变比较(200×)

图2　三组病理损伤评分比较

图3　三组ROS含量比较

2.3三组ROS含量比较IRI组ROS、MDA含量高于假手术组、百里醌组(P<0.01，P<0.05)。见图3、图4。

2.4三组抗氧化应激酶CAT、GPx、SOD的活性比较与假手术组比较，IRI组CAT、GPx、SOD活性降低(P<0.05)，百里醌组与IRI组相比，抗氧化应激酶CAT、GPx 和SOD的活性明显增高(P< 0.05)。见图5。

图5　三组CAT、GPx、SOD活性比较

3讨论

肝脏缺血损伤是临床常见危重症，常继发于移植、休克、外伤、心脏体外大循环手术等，临床表现为肝脏失功、进行性黄疸加深等[1-2]。其致病机制为肝脏缺血诱发体内的大量中性粒细胞被激活，导致大量氧自由基、活性氧产生，引起氧化应激状态[5-8]。因此，抑制氧化应激是减轻肝脏缺血再灌注损伤的有效途径。百里醌是一种境外植物提取的化合物，除具有抗痢疾、哮喘等生物学活性外，还具有抗氧化应激的活性。而氧化应激是肝脏缺血再灌注损伤的重要发病机制[3-4]。

本研究结果显示，肝脏缺血再灌注损伤可导致小鼠肝小叶广泛破坏，广泛肝细胞变形、坏死、肿胀、出血，中性粒细胞浸润，ALT和AST明显增高。而百里醌预处理使上述改变明显减轻。结果表明，百里醌预处理可减轻肝脏缺血再灌注损伤导致的肝脏损伤和肝脏病理结构的改变，但百里醌减轻肝脏缺血再灌注损伤的具体机制不明。

进一步研究发现，肝脏缺血再灌注损伤可导致活性氧自由基以及脂质过氧化终末产物含量明显增高，而抗氧化酶CAT、GPx含量明显降低[6-8]。证实氧化应激是导致肝脏缺血再灌注损伤的重要发病机制，而百里醌预处理明显减轻活性氧自由基和MDA的水平，而CAT、GPx 明显增高。提示百里醌可通过抑制氧化应激而增高抗氧化应激水平，减轻肝脏缺血再灌注损伤。但在肝脏缺血再灌注损伤中，百里醌除干预氧化应激外，是否影响其他信号途径目前仍不清楚，有待深入研究。本研究结果表明，百里醌预处理可通过抗氧化应激而减轻肝脏缺血再灌注损伤，为临床预防治疗肝脏缺血再灌注损伤提供了新的思路。

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作者单位：绍兴市人民医院皮肤科，浙江 绍兴 312000