玫瑰石斛原球茎的诱导与增殖研究

苏 江，陈林发，邓晰朝

（河池学院化学与生物工程学院， 广西 宜州546300）

玫瑰石斛是兰科石斛属多年生草本植物［1］，含吲哚联啶类生物碱，是具有滋阴益胃和生津除烦等功效的中药材［2－6］。此外，玫瑰石斛花大而鲜艳，可供观花和观叶。但由于长期过渡采收，目前野生玫瑰石斛资源急剧减少，甚至在有些地区已到濒临灭绝的境地。近年来，国内学者对多种石斛属植物如铁皮石斛、美花石斛和霍山石斛等进行了组培快繁方面的大量研究，以期保护野生药用石斛资源，满足日益增加的市场需求。关于玫瑰石斛组织培养及快速繁殖的研究鲜有报道，白音等研究发现，1／2MS＋马铃薯提取物20%有利于玫瑰石斛种子萌发［7］。而以玫瑰石斛植株茎段诱导原球茎，并将所得的原球茎进行分化形成丛生芽，再将丛生芽培养成苗的研究尚未见报道。

本试验以玫瑰石斛植株茎段为材料，研究了不同的植物生长调节剂及配比、附加物等因子对玫瑰石斛原球茎的诱导和增殖的影响，以期通过组织培养诱导玫瑰石斛茎段获得原球茎，并对原球茎进行增殖，为进一步诱导玫瑰石斛丛生芽和培养玫瑰石斛小苗提供大量的原材料，从而实现玫瑰石斛快速繁殖目的。

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验所用的玫瑰石斛植株购于广西宜州市中药材市场，并经河池学院邓晰朝副教授鉴定。取生长健壮植株的茎，并切成长3～5cm的茎段作为外植体材料。放入广口瓶中流水冲洗2h，再用洗衣粉水浸泡10～15min，清洗干净后流水冲洗10～15min，待消毒处理。

1．2 试验方法

1．2．1 外植体的消毒试验

用体积百分比75%的酒精浸泡外植体材料25s，进行表面消毒，无菌水冲洗3～4次，再用0．1%升汞进行消毒，时间分别为5、6、7、8、9min。将外植体接种于培养基 MS＋IBA 0．2mg／L上，培养15d后统计污染率和成活率，从而确定最佳消毒时间。

1．2．2 不同植物生长调节剂配比对玫瑰石斛原球茎诱导的影响试验

以MS为基本培养基，并添加不同的植物生长调节剂：6－BA（0、1、2mg／L），NAA（0、0．1、0．2mg／L），IBA（0．1、0．2mg／L），2，4－D（0．1、0．2mg／L），KT（1、2 mg／L）。将消毒好的玫瑰石斛茎段接种到原球茎诱导培养基上，观察原球茎的诱导情况，比较原球茎的诱导时间与诱导率，筛选出适合诱导玫瑰石斛原球茎的植物生长调节剂种类，再通过正交试验选出最佳的植物生长调节剂配比浓度组合。

1．2．3 6－BA与NAA浓度对玫瑰石斛原球茎增殖的影响试验

以 MS为基本培养基，分别添加6－BA（1、2、3 mg／L），NAA（0．1、0．3、0．5mg／L）进行原球茎增殖培养，试验共有9个处理，每个处理接种大小一致的原球茎，30d后观察原球茎增殖情况。

1．2．4 添加不同附加物对玫瑰石斛原球茎增殖的影响试验

以MS为基本培养基，植物生长调节剂配比为NAA 0．5mg／L＋6－BA 1．0mg／L，添加不同的植物添加物如椰汁、马铃薯、香蕉各15%，比较不同的植物添加物对球茎增殖的影响，30d后观察原球茎增殖情况。

以上试验均于河池学院化学与生物工程学院组织培养恒温无菌培养室进行，培养温度控制在（25±2）℃，光照强度2 000lx，每天光照12h。

1．2．5 统计分析

以 Excel 2003软件进行数据处理，SPSS 17．0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2．1 不同消毒时间对玫瑰石斛外植体消毒效果的比较

以0．1%HgCl2对外植体进行不同时间消毒处理。由表1可知，随着消毒时间的延长，污染率和成活率均呈下降趋势，从消毒5min到7min污染率下降的幅度比较小，从消毒7min到9min污染率大幅度下降，而从消毒5min到9min成活率均是大幅度下降。综合比较认为，以0．1%HgCl2消毒8min比较适合玫瑰石斛茎段的消毒。

表1 不同消毒时间对玫瑰石斛外植体消毒效果的比较

2．2 不同植物生长调节剂配比对玫瑰石斛原球茎诱导的影响

由表2可以看出，不同植物生长调节剂配比对玫瑰石斛茎段诱导原球茎的影响有着明显差异。从诱导时间来看，6－BA＋2，4－D组合诱导的时间都比较短，平均为20d；其次是6－BA＋NAA组合，诱导的时间平均为22d；KT＋NAA组合诱导的时间最长，平均为25 d。从平均诱导率来看，6－BA＋NAA植物生长调节剂组合的原球茎平均诱导率为46．91%，明显高于其它植物生长调节剂组合；而6－BA＋2，4－D组合和 KT＋NAA组合的原球茎平均诱导率基本相同，其诱导率分别为37．57%和37．69%；6－BA＋IBA组合的原球茎诱导率最低；综合比较认为，NAA、6－BA、2，4－D比较适合于玫瑰石斛茎段诱导原球茎。

表2 不同植物生长调节剂配比对玫瑰石斛原球茎诱导的影响

表3 NAA、6－BA和2，4－D正交设计水平

2．3 NAA、6－BA和2，4－D不同浓度配比组合对玫瑰石斛原球茎诱导的影响

以 MS为基本培养基，以 NAA、6－BA和2，4－D为因素，以它们各自的不同浓度为水平，采用L9（34）正交设计的方法形成9个处理（见表3）。正交试验结果见表4。

由表4可以看出，不同处理的原球茎诱导率存在一定差异，其中处理2的诱导率最高，可达86．67%；处理9的诱导率最低，仅为14．28%。以原球茎诱导率为指标，对 NAA、6－BA 和2，4－D的不同配比组合对原球茎诱导率的影响进行直观分析，结果见表4，从各因素的K值及极差（R）值可知，该试验因素A即6－BA浓度的R值最大为116．72，而 因素 C 即2，4－D浓度的 R 值最小，为35．16，因此，可初步推断3种不同植物生长调节剂影响玫瑰石斛原球茎诱导率的主次程度为A＞B＞C即6－BA＞NAA＞2，4－D。由 K 值的大小可初步推断促进玫瑰石斛原球茎诱导的 NAA、6－BA 和2，4－D 的不同浓度配比最优水平的组合为A1B2C3，即 MS＋6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 2．0mg／L，该组合不在正交试验设计表中，需要进行验证实验。

方差分析表明，6－BA和NAA对玫瑰石斛原球茎诱导率均有极显著影响，2，4－D对玫瑰石斛原球茎诱导率的影响不显著，见表5。根据直观分析和方差分析，确定6－BA取0．5mg／L、NAA取0．5mg／L，而2，4－D可任意取一浓度水平。

对正交试验的优选组合MS＋6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 2．0mg／L，进行验证实验，共3次重复，平均诱导率为85．89%，其结果与正交试验设计表中的处理2相近，见表6。因此，NAA、6－BA和2，4－D的不同浓度配比最优水平的组合为 A1B2C2，即 MS＋6－BA 0．5 mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 1．0mg／L，该组合最有利于玫瑰石斛原球茎的诱导。

2．4 6－BA与NAA浓度对玫瑰石斛原球茎增殖的影响

以MS为基本培养基，以NAA和6－BA为因素，以它们各自的不同浓度为水平，采用L9（34）正交设计的方法形成9个处理，见表7。正交试验结果见表8。

由表8可以看出，处理1平均增殖系数最高，达到9．37，而平均增殖系数最低的是处理9，仅为1．57。由极差R值可知，该试验6－BA浓度的R值大于NAA的R值，因此6－BA对玫瑰石斛原球茎增殖的影响大于NAA。根据K值的大小，可初步推断促进玫瑰石斛原球茎增殖的6－BA和NAA不同浓度配比最优水平的组合为6－BA 1．0mg／L＋NAA 0．5mg／L，该组合与试验设计表中3号处理一致。

表4 不同浓度植物生长调节剂对原球茎诱导影响的正交试验结果

表5 不同浓度植物生长调节剂对原球茎诱导影响的正交试验方差分析

表6 优选组合6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 2．0mg／L的验证实验结果

表7 6－BA和NAA正交设计水平

由方差分析，可知6－BA对玫瑰石斛原球增殖有极显著影响，NAA对玫瑰石斛原球茎增殖的影响不显著，见表9。根据直观分析和方差分析，6－BA和NAA不同浓度配比最优水平的组合为6－BA 1．0mg／L＋NAA 0．5 mg／L，该组合最有利于玫瑰石斛原球茎的增殖。

2．5 添加不同附加物对玫瑰石斛原球茎增殖的影响

由表10可知，在 MS＋NAA 0．5mg／L＋6－BA 1．0 mg／L培养基中分别附加香蕉、椰汁、马铃薯时，其增殖效果有一定的差异。其中添加椰子汁增殖效果最好，原球茎紧密且长势最好，颜色深绿，不分化；说明椰子汁适合用于原球茎增殖，马铃薯次之；而添加香蕉对原球茎增殖效果较差，且培养过程中容易产生污染，说明香蕉不适合用于玫瑰石斛原球茎增殖。因此，在进行原球茎增殖时可适量添加椰子汁，从而达到提高原球茎增殖的目的。6－BA＋NAA组合、KT＋NAA组合和6－BA＋IBA组合均可诱导玫瑰石斛茎段产生原球茎，但从原球茎诱导时间和诱导率综合比较，6－BA＋2，4－D组合诱导玫瑰石斛原球茎的时间都比较短，平均为20d；6－BA＋NAA植物生长调节剂组合的原球茎平均诱导率明显高于其它植物生长调节剂组合。因此，NAA、6－BA、2，4－D比较适合于玫瑰石斛茎段诱导原球茎。在NAA、6－BA、2，4－D不同浓度配比组合正交试验中发现，6－BA对玫瑰石斛原球茎诱导的影响最大，其次是NAA，而2，4－D的影响最小；方差分析和验证试验结果表明，NAA、6－BA和2，4－D的不同浓度配比最优水平的组合为 MS＋6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．5mg／L＋2，4－D 1．0mg／L，该组合最有利于玫瑰石斛原球茎的诱导，说明低浓度的6－BA与NAA有利于原球茎的诱导，而2，4－D在诱导原球茎的过程中影响并不显著，但加入2，4－D可以缩短诱导时间，因此，在玫瑰石斛原球茎的诱导中适当添加2，4－D是有利的。

表8 6－BA与NAA对玫瑰石斛原球茎增殖影响的正交试验结果

3 小结与讨论

植物组织培养中，植物生长调节剂是最重要的影响因素，不同植物生长调节剂对培养物质的生长有重要作用［8－9］。

本试验以MS为基本培养基，并分别添加不同浓度的6－BA、NAA、IBA、2，4－D 和KT，以期获得适合玫瑰石斛茎段诱导原球茎的植物生长调节剂种类、浓度和最佳组合。结果表 明，6－BA＋2，4－D 组 合、

表9 6－BA与NAA浓度对玫瑰石斛原球茎增殖的影响方差分析

表10 添加不同附加物对玫瑰石斛原球茎增殖的影响

通过原球茎的增殖和分化获得实生苗是石斛属快速繁殖的有效途径，目前关于玫瑰石斛原球茎增殖和分化的研究还鲜有报道。因此，建立玫瑰石斛原球茎增殖体系，对加快玫瑰石斛快速繁殖具有重要的实践意义。本试验以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6－BA和NAA并利用正交设计进行原球茎增殖培养，结果表明，6－BA对玫瑰石斛原球茎增殖的影响大于NAA，二者不同浓度配比最优水平的组合为6－BA 1．0mg／L＋NAA 0．5mg／L，该组合最有利于玫瑰石斛原球茎的增殖。此外，本试验还发现，在MS＋NAA 0．5mg／L＋6－BA 1．0mg／L培养基中分别添加香蕉、椰汁、马铃薯时，对玫瑰石斛原球茎的增殖均有不同程度的影响，其中添加椰子汁增殖效果最好，原球茎紧密且长势最好，颜色深绿，不分化。因此，在进行原球茎增殖时可适量添加椰子汁，以达到提高原球茎增殖的目的。

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