2个水稻品种苗期高温胁迫差异表达基因的克隆与表达

许锦彪，吴春芳，卞晓春，王玲娟，蔡晓东，汪 琴，赵 华，曹云英，3

（1．南通大学图书馆， 江苏 南通226019； 2．南通大学生命科学学院， 江苏 南通226019；3．农业部南方平原玉米观察站， 江苏 南通226019； 4．江苏沿江地区农业科学研究所， 江苏 如皋226541）

水稻分布于亚洲和非洲的热带和亚热带地区。它是一种喜温植物，在各个生长阶段都有其适宜的温度范围，当超过这个范围时，水稻的生长发育就会受到一定的影响，常常会出现产量降低、品质变劣的情况。随着工业的发展，环境也受到了一定的破坏，温室效应愈加明显，水稻遭遇高温胁迫的几率也随之增加，这推动着国内外学者对水稻高温热害的研究，为稳定全球的粮食安全生产作出了贡献［1－5］。

热激蛋白（HSP）是在生物体中广泛存在的一类热应激蛋白质。学者们认为，当有机体暴露于高温（比生物体正常的生长温度高出5℃以上）下时，生物体中大部分正常蛋白质的合成被抑制，植物就会由热激发合成这种蛋白，通过一系列代谢反应来应对高温胁迫，一般表现为降低正常蛋白的合成，加速热激蛋白的转录和翻译，从而来保护机体自身［6］。按照蛋白质的大小，HSP可分为 HSP 110、HSP 90、HSP 70、HSP 60和小分子热激蛋白smHSP（small HSP）5类。由热激诱导合成的蛋白称为诱导型热激蛋白，与正常生活的细胞中的组成型热激蛋白（HSC）在结构和功能上没有明的区别，很难区分，统称为HSP［7］。HSP在生物界中的一个重要特点是它们在进化过程中的高度保守性，这说明它们具有普遍存在的重要生理功能，然而，在这方面的研究迄今为止还不充分，目前为止知道的HSPs的功能主要有2个方面，一是参与新生钛的折叠、运输和组装，二是参与逆境损伤蛋白的修复和降解。

本研究针对前期通过cDNA－AFLP技术的高温差异表达片段，拟克隆该差异表达片段并测序，利用荧光定量PCR技术来检测其在多种逆境下在耐热性不同水稻幼苗叶片中表达量的变化，以期为以后对水稻逆境情况下的分子机制的研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1．1 差异片段DNA的获得

以cDNA－AFLP方法筛选、PAGE凝胶显示的高温差异片段（图1方筐所示）为材料，切胶回收的产物为DNA 模板，用筛选时的引物（5′－GACTGCGTACCAATTCCT－3′和 5′－GATGAGTCCTGAGTAATG－3′）对该差异片段进行PCR扩增，用DNA回收试剂盒（鼎国，北京）对PCR产物进行切胶回收纯化，纯化产物用1%的琼脂糖电泳检测，获得差异片段DNA。

1．2 差异片段的克隆

将 差 异 片 段 DNA 与pGEM－Teasy载 体（Promega，美国）进行连接，连接方法参照载体说明书来进行，连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH 5α，通过添加氨苄、IPTG和X－gal的LB平板培养，蓝白斑筛选阳性克隆，将阳性克隆菌斑进行菌落PCR和酶切鉴定，将鉴定为阳性克隆的菌液委托上海英骏生物技术服务公司进行测序。

1．3 基因片段的序列分析

测序结果去除载体和接头序列后得到所需的差异片段的序列，通过NCBI的BLAST软件进行同源性序列分析，获得该差异片段的基因号。

1．4 差异片段在不同逆境下的荧光定量表达分析

1．4．1 材料与处理

供试品种为敏感型籼稻双桂1号和耐热型品种黄华占。选取饱满种子经800倍液的50%多菌灵浸种48h，再以自来水冲洗干净，清水浸种48h，种子露白时32℃催芽，等芽长半谷长时，室温炼芽后，挑选整齐一致的发芽种子移至浇有Hoagland营养液的盆钵中，共12盆，每个品种6盆，每盆约有50株，于光照培养箱中湿润培养，温度28℃／22℃（昼／夜），光照强度500μmoL／（m·s），光照12h／12h（昼／夜），相对湿度为90%／80%（昼／夜）。待水稻幼苗长至3～4片叶时，将每个品种的6盆水稻分别分为5组；2盆用于42℃／42℃高温处理，1盆用于150mmol／L NaCl处理，1盆用于100μmol／L精胺处理，1盆用于20%PEG 6000模拟干旱处理，1盆作为对照。分别在各处理0，3，6，12，24h及恢复24h取功能叶片于液氮中冷冻，迅速转移到－80℃超低温冰箱中用于总RNA提取。

1．4．2 叶片总RNA的提取及cDNA的合成

参 照 RNAiso－mate for plant tissue 说 明 提 取RNA。通过Nanodrop 2000超微量核酸蛋白测定仪（美国）对RNA样品进行定量检测。cDNA合成采用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time方法来进行，反应体系中包含2μL 5×PrimeScript RT Master Mix，总 RNA＜500ng，加 RNase－free水至10μL。反应程序为37℃，15min；85℃，5s，4℃终止反应。合成产物用于荧光定量PCR。

1．4．3 荧光定量PCR分析

利用 DNAMAN v 5．2．2 引 物 设 计 软 件，根 据NCBI公布的ActinmRNA（AY 212324）和本实验测序所获得序列设计引物。OsActin上游引物为5′－CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA－3′和下游引物 为 5′－CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA－3′；差 异 片 段 Os07g0620200 上 游 引 物 5′－AATGCACTCTGCATGCCCAC－3′，下游引 物为 5′－CCTGTAAACCAGGCCATGTGA－3′。 引 物 由 invitrogen上海贸易有限公司合成。

荧光定量PCR按照SYBR PrimeScript TM RTPCR KitⅡ试剂盒说明操作，其反应体系中含12．5μL SYBR Primx ExTaq Ⅱ、1μL 引 物、0．5μL ROX Referance DyeⅡ、2μL cDNA，加灭菌的双蒸水至25μL。以 OsActin为内参，4个重复，用 ABI 7500 Real－TimePCR仪分析差异片段在各处理下的表达情况。反应条件为95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃34s，循环40次。每一个循环结束时实时测定荧光值，全部循环结束时测量熔解曲线。用ABI 7500Software v 2．0．4测定每一个样品的Ct值（Cycles threshold），用相对定量法分析基因表达水平。

1．5 数据分析

用SPSS 19．0软件进行统计分析数据，用Duncan’s进行处理间差异性检验（p＝0．05），用Sigmaplot 12．0绘制图表。

图1 cDNA－AFLP显示的差异片段（A）、PCR扩增（B）、回收检测（C）和蓝白斑筛选（D）

2 结果与分析

2．1 差异表达片段的克隆

将高温导致的差异表达片段（图1 A）回收后，PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶检测，结果显示为单一条带（图1B）；将该片段凝胶通过试剂盒进行回收纯化（图1C），再将纯化后的cDNA片段与T载体连接，连接产物转化到感受态细胞平板上过夜培养后，筛选阳性克隆白斑（图1D）；对白斑进行菌落和酶切鉴定后送去测序。

2．2 差异表达片段的序列分析

对该差异表达片段克隆后经测序和序列分析后，发现它由307个碱基组成，序列如下：GATGAGTCCTGAGTAATGGCATGTCTGGGGCTCCTTCACA GAATGGGGCACCATCCTACATCCCTTCACAGG CTTCTCAATTTGCAGCTGATAAATACTACACG TCCCCCAACTAATTTGGGGGATAATCTACAGT CTACAAACTAGTAAAGACTAAAGATTACTCA GCCAGGTGGTACAAGAGATCACCAGCTAACT ACAGACACAGGGTACATTTCCAAGGAACACA AGAGCAACATGAGACATGATGACAACAAAC GCAAAGCGACAGCAGAGGATCGGTCCATGCA GGAATTGGTACGCAGTC。对该序列通过BLAST搜索，发现为Os07g0620200基因，编码产物与水稻中的热激蛋白DnaJ N端的结构域同源。

2．3 不同逆境下差异表达片段的荧光定量表达分析

2．3．1 基因表达的有效性

从图2可见，差异表达片段Os07g0620200和内参Os Actin的CT值在20～30之间（图2A、B）；熔解曲线呈单峰（图2C、D），即产物的特异性。说明二者均获得了有效扩增的特异性产物。

2．3．2 高温下Os07g0620200基因的表达

如图3A所示，遇到高温（42℃）时，双桂1号中Os07g0620200基因的表达在各个时间点之间的变化明显，0～3h之间有显著的增加，之后开始下降，在高温处理24h后，该基因的表达趋近于0。与常温对照相比，除了处理24h低于对照外，其余各时间点该基因的表达量均显著高于对照；而在黄华占品种中，高温下Os07g0620200基因在各时间点的表达量虽有所差异，但差异并不大，总体上呈上升趋势，24h表达量达到最大（图3E）。与常温对照相比，除了处理12h略低于对照外，其余各时间点该基因的表达量均显著高于对照。从2个品种到达最大表达量的时间相比，双桂1号（3h）早于黄华占（24h），表明双桂1号对高温的反应更早，更为敏感。恢复24h后，双桂1号中Os07g0620200基因的表达量有明显回升，但仍低于起始量，而黄华占中该基因的表达有所下降，但高于起始量，两者均高于同期对照。

2．3．3 干旱胁迫下Os07g0620200基因的表达

如图3B、F所示，2个品种在干旱胁迫下该基因的表达情况显示了2种完全不同的表现，前者为先上升后下降的趋势，变化范围较大，6h时干旱胁迫明显激活了该基因的表达，6～12h处在一个较高的表达水平，且在胁迫处理期间表达量明显高于对照（图3B）；后者则截然相反，呈先下降后上升的趋势，基因表达相对稳定（图3）。而且，在6h时双桂1号中该基因的表达量几乎达到了最大值（起始量的2倍多），黄华占则为最低点（起始量的一半左右）。与常温对照相比，恢复24h后，两者表现明显不同，该基因的表达在双桂1号中急剧减少，显著低于起始量，与对照相当，而在黄华占中的表达有明显的增加，显著高于其起始表达水平，显著高于同期对照。

2．3．4 盐胁迫下Os07g0620200基因的表达

图2 Os07g0620200基因和内参Os Actin的扩增曲线和熔解曲线

如图3C、G所示，在高盐（150mmol／L）处理下，双桂1号和黄华占2个水稻品种中Os07g0620200基因的表达有明显的差异。对于双桂1号来说，随着盐胁迫时间的延长，该基因的表达量呈现先快速下降后缓慢上升的趋势，但直至胁迫24h时，该基因的表达水平仍低于胁迫前水平。与对照相比，在0～12h期间与对照持平，胁迫24h明显高于对照。黄华占在盐胁迫下该基因的表达总体呈上升趋势，在0～12h内上升趋势比较缓慢，24h则表现出盐胁迫对黄华占中

Os07g0620200基因表达的明显激活作用，其表达水平快速增加，几乎达到了起始量的3倍多。与对照相比除胁迫12h明显低于对照外，其余时间均明显高于对照。恢复24h后，双桂1号中该基因的表达水平恢复到胁迫起始量，黄华占则增加到更高的表达水平，两者均高于同期对照。

2．3．5 精胺（Spm）对Os07g0620200基因表达的影响

由图3D、H所示，在通过外源Spm喷施叶片后，双桂1号中该基因的表达变化相对稳定，在12h内该基因表达量变化不大，但24h时与初始相比明显下降；而黄华占变化较大，3h该基因表达量明显低于起始表达量，6h高于起始值，12h达到最大表达量，是起始时的4倍左右，24h低于起始量，但仍高于双桂1号此时的表达量。与对照相比，外源Spm处理增加双桂1号中该基因的表达水平（24h与对照相当除外），黄华占在0～3h变化不大，24h明显低于对照，在6～12h期间明显高于对照，且黄华占增加的幅度大于双桂1号。恢复24h后双桂1号与对照相当，但明显低于胁迫前起始量，而黄华占则明显高于起始量及对照。

2．3．6 各处理间表达量的比较

对该基因在不同逆境处理下0～24h内的表达量进行方差分析结果（表1）表明，双桂1号和黄华占2个品种各处理间Os07g0620200基因表达水平均极显著高于对照，双桂1号各处理间的表达高低依次为PEG处理＞高温处理＞Spm处理＞NaCl处理＞对照。黄华占则为NaCl处理＞Spm处理＞高温处理＞PEG处理＞对照。这表明PEG、高温、Spm及NaCl等非生物胁迫，均诱导了Os07g0620200基因的表达，但不同胁迫处理下表达模式有所不同。2个品种比较，黄华占中Os07g0620200基因的表达量始终高于其在双桂1号中的表达量，除PEG处理稍低外。

表1 不同逆境处理下2个水稻品种Os07g0620200基因表达的多重比较（Duncan检测）

图3 2个品种中Os07g0620200基因在不同处理下的表达分析

3 讨 论

本研究中克隆前期筛选的Os07g0620200基因，发现它的编码产物与水稻中的热激蛋白DnaJ N端的结构域同源。含有DnaJ结构域的蛋白统称为DnaJ蛋白。DnaJ蛋白是热激蛋白的一种辅助蛋白，激活HSP 70的ATPase而调控其活性，在逆境下能调控热激蛋白的形成。DnaJ结构域在细胞中具有多种功能，除了决定HSP 40和HSP 70相互作用的专一性，并使一种特定的HSP 40蛋白质在HSP 70家族中挑选出对应的分子外，还有新生蛋白的折叠、胞吞作用、多肽穿过细胞器质膜的转运、调整对各种胁迫的反应及对预降解蛋白的靶定等功能［8－9］。因此，推测本研究中克隆的差异基因Os07g06202004在水稻逆境中应对各种胁迫有关。在许多生物中都有类似DnaJ蛋白的存在，如拟南芥、水稻等［10－13］。在水稻中目前已报道有101个编码DnaJ蛋白的基因，通过比较发现本研究中的Os07g0620200基因不是其中之一，它的具体功能有待下一步研究。

在非生物逆境下，正常蛋白质合成减少，而热激蛋白的合成会增加。刘大丽等［14］报道了在盐（NaCl、NaHCO3和 Na2CO3），PEG，高 pH 值（pH＝8．0和pH＝11．0）以及热激（50℃）下，水稻根中的rHsp 90基因都受到了不同程度的诱导。陈新海等［15］报道了高温胁迫下水稻叶片中的多种热激蛋白的表达量上调。本研究中通过荧光定量分析PEG、高温、Spm及NaCl等非生物胁迫下Os07g0620200基因表达，发现所有胁迫均诱导了该基因的表达（图3）。这与前人的结论相似。表明该基因参与逆境胁迫。此外，在不同耐性水稻品种中，该基因的表达量存在明显的差异。有研究表明，热激蛋白在高温胁迫下的不同耐性品种中出现表达差异，耐高温水稻的表达量高于敏感型水稻的表达量。而且随着高温胁迫时间的延长，耐高温水稻的sHSP表达量未出现明显的下降趋势［15］。肖清铁等［16］发现抗镉水稻品种中热激蛋白上调表达，镉敏感水稻品种中热激蛋白的表达无显著差异。本研究结果表明，高温、盐胁迫、模拟干旱胁迫均增强了该基因的表达，还表明耐性品种Os02g0611200基因的表达量始终高于敏感品种，敏感品种响应逆境的时间较早，后期表达量较低，恢复正常条件后，表达量低于或与初始值相当，而耐性品种的表达量则均显著高于初始值。即耐热品种黄华占中热激蛋白的大量合成可能是具有更强的抵抗逆境能力的原因之一。

多胺（腐胺、精胺、亚精胺）是一种重要生理活性物质，它能调控植物的生长发育。研究表明外源多胺可以增强植物对逆境的抗性，这在许多植物中已得到证实。如魏秋平等［17］发现，0．01mmol／L 精胺有缓解拟南芥盐害的作用。古红梅等［18］发现冷胁迫处理时外源1mmol／L亚精胺处理能明显提高小麦幼苗的耐冷性。本研究发现0．1mmol／L精胺明显提高了2个耐性不同水稻Os 02 g0611200基因的表达量，耐性品种表达量明显高于敏感品种。表明外源多胺可以促进基因转录水平。

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