ANXA2对Caco2细胞凋亡的影响

ANXA2对Caco2细胞凋亡的影响

奉艳， 肖丽， 何慧敏， 高宁， 石红燕， 马乐乐，

达苗苗， 胥谨慧， 许楠， 刘雨恩， 宋喜贵， 侯颖春*

(陕西师范大学 秦巴山区可持续发展协同创新中心， 陕西 西安 710119)

摘要：为研究膜联蛋白A2(ANXA2)基因与人结直肠癌Caco2细胞凋亡之间的关系，采用RNAi技术沉默Caco2细胞的ANXA2表达后，利用流式细胞仪分析细胞凋亡水平，并利用激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜对凋亡细胞进行形态学检测。流式细胞仪检测结果显示,ANXA2表达被抑制后细胞线粒体正常膜电位发生改变(P<0.05)，线粒体结构受损；同时，形态学检测结果表明,ANXA2表达被抑制后细胞出现了较为明显的凋亡样特征。结果提示：ANXA2在人结直肠癌Caco2细胞的高表达能一定程度地促进细胞生长，抑制ANXA2表达可以诱导细胞出现一定程度的凋亡样形态特征，但不足以引起细胞广泛而明显的凋亡;推测ANXA2表达水平并不是唯一影响瘤细胞凋亡的因素。该结果支持关于ANXA2具有作为肿瘤靶向诊断、治疗靶分子潜能的推论。

关键词：膜联蛋白A2； 结直肠癌细胞； 细胞凋亡； 基因表达； 基因功能

中图分类号：R735.3文献标志码： A

文章编号：1672-4291(2015)01-0080-06

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2015.01.411

收稿日期：2014-07-09

基金项目：国家社会科学基金资助项目(12BJY131)

The effect of ANXA2 expression on the apoptosis of Caco2 cells

FENG Yan, XIAO Li, HE Huimin, GAO Ning, SHI Hongyan, MA Lele,

DA Miaomiao, XU Jinhui, XU Nan, LIU Yuen, SONG Xigui, HOU Yingchun*

(Co-Innovation Center for Qinba Region′s Sustainable Development,

Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi, China)

Abstract:To study the relationship between ANXA2 and the apoptosis of Caco2 cells, the expression of ANXA2 in Caco2 cells was inhibited by siRNA. Cell apoptosis was further investigated by flow cytometry (FCM), and morphological characteristics were observed with laser scanning confocal microscopy (CLSM) and transmission electron microscopy (TEM). The results showed that the fluorescence density of the cells was significantly reduced in ANXA2 interfered groups(P<0.05), suggesting that the normal membrane potential of mitochondria has been changed. Moreover, some characteristics of apoptosis cells were also observed in ANXA2 silenced cells compared to control group. Taken together, these results indicate that the excessive expression of ANXA2 in Caco2 cells could promote the proliferation of Caco2 cells. Moreover, some morphological characteristics of apoptosis may be induced by silencing ANXA2 in Caco2 cells, but it is insufficient to cause widely apoptosis or obvious characteristics of cell apoptosis. We suppose that the excessive expression of ANXA2 is not unique route of anti-apoptosis factors of tumor. These results further confirm that ANXA2 has great potential as a targeting molecule of tumor diagnosis and treatment.

Key words: ANXA2; colorectal carcinoma cells; cell apoptosis; gene expression; gene function

膜联蛋白A2(ANXA2)是钙依赖性磷脂结合蛋白多基因家族中的一员[1]，广泛分布于各种真核细胞膜、细胞质和细胞外，其含量高达细胞总蛋白质的0.5%～2%[2].其功能主要是参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动[3]，包括胞吐作用中的膜融合[4]、囊泡运输、细胞黏附[5]、细胞增殖[4]、凋亡、DNA复制[6]、信号传导[7]以及离子通道的形成[8]。ANXA2的异常表达与包括癌症在内的人类许多疾病的发生发展密切相关[9-11]，且其作用机理根据肿瘤类型的不同也存在差别[12-14]。

ANXA2在人结直肠癌组织/细胞高表达[15]，有望成为结直肠癌的一个潜在诊断、治疗和预后标志物。前期研究表明,Caco2细胞ANXA2的表达量与其增殖、迁移等多种生物学行为能力呈正相关[16]。本实验将靶向ANXA2的干扰重组质粒导入Caco2细胞后，利用流式细胞仪分析其凋亡水平；利用激光共聚焦显微镜观察经MitoView633染色后细胞的凋亡形态特征；利用透射电子显微镜观察细胞整体形态以及内部结构变化；对ANXA2与Caco2细胞凋亡的关系进行初步探讨。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人结直肠癌细胞株Caco2购自美国ATCC,本实验室保存。

1.1.2重组质粒设计靶向ANXA2的干扰质粒pU6H1-GFP-siANXA2-1(5′-TGTGTGGTGGAGATGACTGA-3′)和错义对照质粒pU6H1-GFP-siRNASCR(5′-GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC-3′)由百奥生物技术(南通)有限公司构建合成。

1.1.3仪器与试剂DMIL LED倒置荧光显微成像系统(德国Leica公司)，激光共聚焦扫描显微镜(德国Leica公司)，JEM-2100高分辨率透射电子显微镜(日本电子公司)，流式细胞仪(Millipore)；DMEM培养基为Invitrogen公司产品，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物公司，链霉素、青霉素、庆大霉素及胰蛋白酶购于西安沃尔森公司， Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ为Omega产品，S-TranG转染试剂购自南京探求生物技术公司， MitoView 633购自美国Biotium公司，电镜级戊二醛固定液为Sigma产品。

1.2方法

1.2.1质粒制备 pU6H1-GFP-siANXA2-1和pU6H1-GFP-siRNASCR质粒的制备按Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ说明书进行。

1.2.2细胞培养及转染 Caco2细胞用DMEM培养基(含10 % FBS、100μg/mL链霉素、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL庆大霉素)于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件培养。将对数生长期细胞以2.5×105接种于含盖玻片的培养皿(30 mm)，使细胞融汇率在24 h内达60%~70%，此时参照S-TranG试剂说明书进行质粒pU6H1-GFP-siANXA2-1(实验组，A1)和pU6H1-GFP-siRNASCR(对照组，NT)细胞转染。同时设野生组(WT，以PBS代替质粒用量)，每24 h更换一次培养基。转染60 h后，利用倒置荧光显微成像系统以细胞GFP表达情况估算转染效率：转染效率=绿色荧光细胞数/相同视野下细胞总数×100%。

1.2.3流式细胞仪检测 取转染后96 h的各组培养皿， PBS洗去漂浮细胞；加MitoView 633工作液(母液用DMEM培养基按1∶100比例稀释)覆盖整皿细胞，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗去多余染液；0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞；DMEM终止消化，制成细胞悬液；细胞计数，调整细胞密度至200个/μL；加样于96孔板，每孔200 μL，每组设两个复孔，流式细胞仪检测荧光强度。

1.2.4激光共聚焦扫描显微镜观察 取转染后96 h的各组盖玻片，PBS洗去漂浮细胞；滴加MitoView 633工作液于盖玻片，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗去多余染液；甘油封片，激光共聚焦显微镜观察成像(MitoView 633激发光波长633 nm)。

1.2.5透射电子显微镜观察取转染后96 h各组细胞用DMEM制成悬液；室温，800 r/min离心3 min；弃上清，重悬于1 mL 37 ℃预热的PBS，转移至1.5 mL EP管；室温，1 000 r/min离心10 min；弃上清，加入约500 μL 2.5%戊二醛固定液，4 ℃固定细胞24 h；预冷PBS洗细胞，1%锇酸进行再固定；梯度酒精脱水；环氧树脂包埋；常规超薄切片制样；醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色；透射电子显微镜观察，数码成像系统进行图像采集。

2 结果

2.1质粒转染效率评估

以S-TranG试剂转染重组质粒60 h后细胞GFP的表达如图1所示。转染效率>80%。

图1　转染60 h后Caco2细胞转染效率评估

2.2流式细胞仪检测caco2细胞凋亡

线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆事件，引起一系列线粒体相关变化。MitoView 633是一种远红外线粒体荧光染料，在正常细胞中依据线粒体膜电位的存在，逐渐扩散进质膜并沉积在线粒体内，在激发光下放出荧光。流式细胞仪结果显示(图2)：转染96 h后，相较于野生组(WT)、对照组(NT)，ANXA2抑制组(A1)荧光强度有明显的降低(P<0.05)，表明A1组细胞线粒体的正常膜电位降低或者消失，导致MitoView 633染料不能透过质膜或者透过质膜却在线粒体基质的沉积量有所减少，进而显示为荧光强度的减弱。

图2　流式细胞仪检测Caco2细胞线粒体膜电位变化

2.3激光共聚焦扫描显微镜观察

MitoView 633染色细胞线粒体结果显示(图3)：转染96 h后，WT(野生组)、NT(对照组)细胞线粒体发出明亮的红色荧光；而ANXA2干扰组细胞线粒体仅发出微弱的红色荧光，偶见明亮的红色荧光团(箭头所示)。此结果与流式细胞仪量化分析结果一致(图2)。

图3　Caco2细胞经MitoView 633染色后激光

2.4透射电子显微镜观察

透射电镜观察结果显示(图4)：转染96 h后，野生组细胞多呈圆形或椭圆形；细胞质膜结构完整、轮廓清晰；细胞质浓密均匀(图4a)。对照组细胞内部超微结构与野生细胞基本一致(图4b)。ANXA2表达抑制组细胞内部超微结构发生了变化。主要表现在：细胞轮廓模糊，质膜受损(分层、断裂等)严重；胞质结构疏松混乱，胞浆内散在大量膜性空泡；核内染色质浓缩且边缘化(图4c)。

图4　Caco2细胞透射电子显微镜观察结果

3讨论

细胞凋亡是多细胞生物发育过程中不可或缺的一种自稳机制。肿瘤组织由于无限制的生长需要，常需要抑制自身的细胞凋亡，而出于肿瘤治疗的目的，肿瘤细胞需要被诱导凋亡。细胞凋亡是多基因严格控制的过程，具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。现有资料显示：肿瘤发展过程中，其抗细胞凋亡能力明显加强，瘤细胞凋亡率明显降低[17]。研究表明，许多肿瘤相关基因在肿瘤细胞抑制凋亡过程中扮演了重要角色[18]。所以，这种“凋亡抑制”促进了肿瘤的生长失控、转移等特点[19]。某些肿瘤治疗研究策略就是通过加强肿瘤细胞凋亡诱导机制，抑制其抗凋亡基因表达。

据报道,ANXA2与多种肿瘤的发生进程相关，可以调节肿瘤细胞的增殖、运动等，并参与调节表皮生长因子受体( EGFR)信号传导途径，通过酪氨酸残基磷酸化将外界信号传导至细胞内，再通过Ras和PI3K途径将信号传递至细胞核，调控靶基因表达[20]。ANXA2也可参与抑癌基因p53诱导的细胞抗凋亡路径[21]。沉默ANXA2表达后发现淋巴瘤Jurkat细胞凋亡水平增加，表明ANXA2 基因在 Jurkat 细胞生长过程中可以拮抗凋亡[22]。研究发现，糖原合成酶激酶-3和Omi/HtrA2可以诱导ANXA2裂解，进而阻抑细胞周期，促进细胞凋亡[23]。降低ANXA2表达后，细胞对死亡反应敏感，可能与NF-jB信号前体的活性降低相关[24]，也可通过上调COX-2 基因表达进而上调NF-kB表达以拮抗凋亡[25]。ANXA2可能会调节一些凋亡相关蛋白因子(如Caspases8、p53、Bcl2等)的表达活性，抑制细胞内相关凋亡信号通路[26]。但是，肿瘤细胞的抗凋亡机制有多种信号途径参与[27]，ANXA2途径不是促瘤细胞抗凋亡的唯一途径。

本实验通过抑制人结直肠癌Caco2细胞ANXA2表达，研究ANXA2基因与肿瘤细胞凋亡的关系。流式细胞仪检测结果显示(图2)：转染96 h后，ANXA2表达抑制细胞的线粒体荧光强度明显降低，表明其线粒体的正常膜电位发生改变，提示细胞的凋亡趋势。激光共聚焦显微镜检测结果显示(图3)：转染96 h后，对照组细胞线粒体发出明亮的红色荧光，细胞凋亡趋势不明显；而ANXA2抑制细胞，凋亡趋势明显：线粒体仅发出微弱的红色荧光，偶见明亮红色荧光团，推测其可能是凋亡后期核染色质断裂为大小不等的片段与线粒体一起聚集，为反折的细胞膜包围，形成凋亡小体所致。透射电镜观察结果显示(图4)：ANXA2表达抑制细胞体积缩小，胞质结构混乱,胞浆中出现膜性空泡，膜性细胞器散乱分布等；染色质浓缩、凝聚、边缘化分布。

本实验室构建的ANXA2敲除的结直肠癌细胞系(ANXA2-/-Caco2)复苏后不易贴壁，生长迟缓，但细胞仍能正常存活，说明ANXA2表达不是唯一影响瘤细胞凋亡的因素，但与敲低相比，敲除ANXA2基因能更有力地抑制癌细胞的增殖、迁移、浸润等能力。

总之，本研究运用RNAi技术下调Caco2细胞的ANXA2表达，细胞出现了一定程度的凋亡现象，说明ANXA2的表达与癌细胞的增殖、抗凋亡相关，但ANXA2的高表达可能不是Caco2细胞强大增殖力、抗凋亡力的唯一诱导因素。

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〔责任编辑王勇〕

第一作者：冯庆，女，博士研究生，研究方向为旅游经济运行分析。E-mail: fengbecky@hotmail.com

*通信作者：孙根年，男，教授，博士生导师。E-mail:gnsun@snnu.edu.cn