四种旋毛虫肌幼虫囊包染色方法的比较探讨

马开明，王耀辉，吴　铭，樊　航，闫钰鑫，蔡　欢，牛利娜，李　丹，王国英*

(1. 河南大学医学院 细胞与分子免疫学实验室, 河南 开封 475004；2. 河南大学 医学院，河南 开封 475004)

四种旋毛虫肌幼虫囊包染色方法的比较探讨

马开明1，王耀辉1，吴铭2，樊航2，闫钰鑫2，蔡欢2，牛利娜2，李丹2，王国英1*

(1. 河南大学医学院 细胞与分子免疫学实验室, 河南 开封 475004；2. 河南大学 医学院，河南 开封 475004)

摘要：目的比较4种染色方法制作旋毛虫肌幼虫囊包标本的效果。 方法①醋酸卡红(含铁)染色液染色：染色1.5 h，不分色；②固绿染色液染色：染色4 s，不分色；③醋酸明矾卡红色液染色：染色30 h，分色；④乙醇硼砂卡红染色液染色：染色 22 h，不分色。结果醋酸明矾卡红染色制作的标本囊包轮廓清晰，梭形显著，与周围组织分界明显，囊壁内、外层空隙明显，囊内幼虫清晰。结论醋酸明矾卡红染色制作的标本，染色效果好，易于观察。

关键词：旋毛虫；肌幼虫囊包；染色; 比较

中图分类号：R383.1

文献标识码：A

文章编号：编号： 1672-7606(2015)01-0043-03

收稿日期：2014-10-16

基金项目：河南大学医学院2014年度卓越医师计划项目(2014-17)。

作者简介：马开明(1957-)，男，实验师，山东鄄城人，从事实验技术及实验教学的工作。

通讯作者：*王国英(1962-)，女，山西运城人，硕士，高级实验师，从事寄生虫免疫及寄生虫病流行病学的教学和科研工作。

Abstract:ObjectiveA comparative staining effect of four staining methods for specimen of Trichinella spiralis encapsulated larvae. Methods1) The specimen were stained with Acetate-carmine staining solution for 24 h, and without fading. 2) The specimen were stained with fast green staining solution for 4 s,and without fading. 3) The specimen were stained with acetate alum carmine staining solution for 30 h,and faded. 4) The specimen were stained with alcohol borax carmine staining solution for 22 h,and without fading. ResultsThe results showed that with the acetate alum carmine staining method, specimen had clearly defined capsule edges. It was prominence that third dimension structures of capsulate. The results also showed that the larva, cyst internal layer, cyst external layer and muscle cells were distinguished clearly.Conclusion Capsule showed obvious figure that specimen of acetate alum carmine staining method.

A Comparative Study of Four Staining Methods for specimen of Trichinella spiralis encapsulated larvae

MA Kaiming1, WANG Yaohui1, WU Ming2, FAN Hang2, YAN Yuxin2, CAI Huan2, NIU Lina2, LI Dan2, WANG Guoying1*

(1.LaboratoryofCellularandMolecularImmunology，MedicalCollege，HenanUniversity，Kaifeng,Henan475004，China；2.MedicalCollegeOfHenanUniversity，Kaifeng,Henan475004，China)

Key words: Trichinella spiralis; encapsulated larvae; staining; comparison

旋毛虫病是一种严重的人兽共患寄生虫病，为我国进、出口肉类的首检和必检病种[1]。此病对人类健康和畜牧业生产均构成严重威胁，位列我国三大人兽共患寄生虫病之首(旋毛虫、囊虫及棘球蚴)。在活检的肌肉中查到旋毛虫肌幼虫囊包是确诊旋毛虫病的病原学诊断依据[2]。制作结构清晰的旋毛虫肌幼虫囊包标本对临床诊断和实验教学具有重要意义。为寻找较好的染色制片方法，我们将4种染色方法用于旋毛虫肌幼虫囊包标本制作，并对染色效果进行比较观察，旨在得到更好的染色制片效果。

1材料与方法

1.1　主要试剂

1.1.1固定液甲醛 6 mL、体积分数为 95%乙醇20 mL、冰醋酸1 mL、蒸馏水40 mL，混合均匀。

1.1.2醋酸卡红(含铁)染色液[3]取100 mL 体积分数为45%冰醋酸，煮沸后徐徐加入卡红1 g，搅拌均匀后加入0.2 g铁锈，煮沸10 min，冷却后过滤，避光贮存在棕色瓶内。使用时将原液与蒸馏水按1∶4 的比例配制。

1.1.3固绿染色液固绿0.1 g，溶于体积分数为95%乙醇100 mL中。

1.1.4醋酸明矾卡红染色液[4]钾明矾4 g，卡红2 g，蒸馏水50 mL，冰醋酸5 mL。将明矾溶于水中煮沸，加入卡红继续煮沸5 min，以玻棒搅拌至卡红溶解为止。冷却后置棕色瓶中放于窗口，阳光下曝晒2~7 d后过滤，再加入冰醋酸。

1.1.5乙醇硼砂卡红染色液[4]量取96 mL蒸馏水，加入4 g硼砂搅拌至溶解，配成40 g/L硼砂水溶液；将卡红1 g加入硼砂水溶液内，煮沸约5 min，使之溶解，然后加入体积分数为70%乙醇100 mL。2~4 h后过滤，备用。

1.1.6分色液体积分数为2%盐酸乙醇。

1.2　标本采集、制片、固定

旋毛虫引自河南省疾病预防控制中心。10 只昆明小鼠，体质量18~22 g，雌性，购自郑州大学实验动物中心。每只鼠经口感染200 条肌幼虫，感染后30 d引颈处死，生理盐水清洗，置4 ℃冷却2 h。膈肌剪为长、宽各约0.5 cm，其他部位肌肉剪成如绿豆大小，夹2张载玻片之间，轻轻加压、细线捆扎，制成制片。置固定液中24 h，取出后解线，流水冲洗 10 min,蒸馏水冲洗5 min。

1.3　染色

1.3.1醋酸卡红(含铁)染色制片置染色液 1.5 h 后取出，蒸馏水冲洗5 min，然后依次放入体积分数为50%、70%、80%、95%和100%乙醇中脱水，各30 min；无水乙醇与二甲苯(1∶1)混合液中透明30 min，纯二甲苯30 s。在载玻片上滴 2 滴中性树胶，将制片放入，加盖玻片，平置标本盒内，室温阴干。

1.3.2固绿染色固定后的制片依次放入体积分数为50%、70%、80%乙醇中各30 min；固绿染液染色4 s，取出后，蒸馏水冲洗2 min；制片放入体积分数为95%、100%乙醇中各30 min；无水乙醇与二甲苯(1∶1)混合液中透明30 min，纯二甲苯30 s。在载玻片上滴 2 滴中性树胶，将制片放入，加盖玻片，平置标本盒内，室温阴干。

1.3.3醋酸明矾卡红染色固定后的制片置染色液中30 h，取出后蒸馏水冲洗至标本不脱色为止。体积分数为2%盐酸酒精分色液中分色10 min，然后依次放入体积分数为50%、70%、80%、95% 和100% 乙醇中脱水，各30 min；无水乙醇与二甲苯(1∶1)混合液中透明30 min，纯二甲苯30 s。在载玻片上滴 2 滴中性树胶，将制片放入，加盖玻片，平置标本盒内，室温阴干。

1.3.4乙醇硼砂卡红染色固定后的制片置染色液中 22 h，取出后蒸馏水冲洗 2 min，然后依次放入体积分数为 50%、70%、80%、95% 和 100% 乙醇中脱水，各 30 min；无水乙醇与二甲苯(1∶1)混合液中透明 30 min，纯二甲苯 30 s。在载玻片上滴 2 滴中性树胶，将制片放入，加盖玻片，平置于标本盒内，室温阴干。

2结果

2.1　醋酸卡红(含铁)染色制作的标本

光镜下观察，标本呈深桃红色；囊包色泽与肌纤维相近，囊壁外层与周围分界不清，囊壁内、外层之间有明显空隙，囊壁内层着色均匀且较深；虫体蜷曲，呈较浅的桃红色，较易辨认。见图1 。

2.2　固绿染色制作的标本

光镜下观察，肌纤维被染成深绿色；囊包所在位置被染成浅绿色，囊包无明显轮廓，与周围分界不清，囊壁内、外之间无明显界限；虫体蜷曲，轮廓模糊，不易观察。见图2。

2.3　醋酸明矾卡红染色制作的标本

光镜下观察，肌细胞呈较浅的咖啡色；囊包梭形显著，囊外壁较薄，与周围分界明显，囊内呈深咖啡色，囊壁内、外层之间有明显空隙，囊包与周围肌细胞能较明显地区分；幼虫淡染，能清晰地辨认。见图3。

图3　醋酸明矾卡红染色标本

2.4　乙醇硼砂卡红染色制作的标本

光镜下观察，囊包结构模糊，无明显轮廓，与周围肌细胞界限不易区分；肌细胞呈较暗的粉红色；内、外囊壁之间无明显界限；虫体淡染，轮廓可辨认。见图4。

3讨论

通过染色可使不同的组织颜色相异，并在光镜下有较好的显示，典型特征清晰显现，可以优化教学效果。旋毛虫肌幼虫囊包常用固绿、卡红、苏木精类染液染色，常规染色一般为单染。

固绿属胞质染料，系人工合成，特点是染色速度快。本实验结果表明，固绿染色制作的标本，囊包无明显轮廓，虫体不易观察。染色效果不佳。

卡红是一种天然染料，常用于绦虫、吸虫的染色制片[5-6]。 我们的实验将卡红用于旋毛虫肌幼虫囊包染色，结果显示，醋酸卡红(含铁)染色液、醋酸明矾卡红染色液、乙醇硼砂卡红染色液 3 种染液，虽然染料均为卡红，由于配方不同，通过染制旋毛虫肌幼虫囊包，染色效果差别较大。醋酸明矾卡红染色制作的标本，囊包轮廓清晰，梭形显著，与周围组织分界明显，囊壁内、外之间层有明显空隙；囊内幼虫能清晰的辨认。醋酸明矾卡红染色液染色效果较好，制作的标本结构清晰，着色适度，便于观察。

参考文献：

[1] 许汴利,杜尊伟,赵旭东.我国部分省市旋毛虫病的血清学调查研究[J].中国人兽共患病学报，2009,25(10)：1 021-1 024.

[2] 詹希美. 人体寄生虫学[M].5版.北京：人民卫生出版社，2001：216-219.

[3] 皮本伟，牛利娜，李丹，等. 旋毛虫肌幼虫囊包染色标本制作方法的改进[J].中国病原生物学杂志，2012,7(1):48-49.

[4] 陈佩惠, 孔德芳, 李惠珠,等.人体寄生虫学实验技术[M].北京:科学出版社, 1988：15.

[5] 纪伟华, 郭冀玲.带绦虫妊娠节片标本制作方法的研究[J].中国人兽共患病杂志, 2001,17(4):73-74.

[6] 邱莎莎, 邓晓. 长期保存姜片虫标本固定及染色方法的改进[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2008,26(3):239-240.

[责任编辑姬荷]