HPLC法同时测定灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量

黄　攀，刘湘丹，马　铭，卢岳华

(1. 湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室, 中国 长沙　410081； 2.湖南中医药大学药学院，中国 长沙　410208)

HPLC法同时测定灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量

黄攀1，刘湘丹2，马铭1，卢岳华1*

(1. 湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室, 中国 长沙410081； 2.湖南中医药大学药学院，中国 长沙410208)

摘要目的：建立灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量测定方法． 方法：以甲醇-乙酸乙酯(V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1)提取处理血浆，氮气吹干后流动相复溶进样．色谱条件: Johnson spherigel C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相: 甲醇-0.01%乙酸水溶液，梯度洗脱；检测波长: 马钱苷为235 nm，阿魏酸和二苯乙烯苷为320 nm；流速: 1 mL/min；柱温: 30 ℃；进样量: 10 μL． 结果：空白血浆中内源性物质不干扰样品的测定．马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷分别在0.03~3.00，0.03~3.00和0.02~2.00 mg/L范围内均有良好的线性关系(r≥0.999) ，检测限依次为0.020,0.015和0.010 mg/L；提取回收率分别大于79%、74%和58%，日间、日内精密度(RSD)均分别小于10%,7.3%和9.7%．结论：所建立的含量测定方法操作简便，灵敏，准确，适用于大鼠灌胃补肾通络方后血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的同时测定，为补肾通络方中有效成分药动学研究提供参考．

关键词补肾通络方；马钱苷；阿魏酸；二苯乙烯苷；血药浓度；高效液相色谱法

Simultaneous Determination of Loganin, Ferulic Acid and Stilbene Glucoside

in Rat Plasma after Ig Administered with Bushen Tongluo Formula by HPLC

HUANGPan1,LIUXiang-Dan2,MAMing1,LUYue-Hua1*

( 1. Key Laboratory of Chemical Biology and Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education of China,

Hunan Normal University, Changsha 410081, China;

2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

AbstractObjectiveTo establish an HPLC method for extracting and determining the loganin, ferulic acid and stilbene glucoside in rat plasma after ig administered with Bushen Tongluo Formula. MethodsThe plasma was extracted and treated with a mixture of methanol and ethyl acetate (3∶1=V∶V), then plasma extract evaporated to dryness under a stream of nitrogen flow, and the residue was reconstituted in HPLC mobile phase to inject. The conditions of chromatography: the chromatographic separations was performed on Johnson spherigel C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm particle size) with a mobile phase composed of methanol-water (from 30∶70 to 50∶50,V/V) containing 0.01% glacial acetic acid at a flow of 1 mL/min. Loganin was determined at 235 nm, ferulic acid and stilbene glucoside were determined at 320 nm. The temperature of column was 30 ℃. The inject volume was 10 μL. ResultsThe method showed good linearity and no endogenous material interfered with the marked compounds. The linear range of loganin, ferulic acid and stilbene glucoside was 0.03~3.00,0.03~3.00 and 0.02~2.00 mg/L, respectively(r≥0.999), the limit of quantification was 0.020, 0.015, and 0.010 mg/L, the extraction recovery was over 79%, 74% and 58%, within-day and between-day precisions were less than 10%, 7.3% and 9.7%, respectively. ConclusionThe established method is accurate, sensitive and convenient for detecting blood concentration of loganin, ferulic acid and stilbene glucoside. It could provide a renference for studying pharmacokinetics of active ingredients in Bushen Tongluo Formula.

Key wordsBushen Tongluo Formula; loganin; ferulic acid; stilbene glucoside; blood concentration; HPLC

补肾通络方是临床常用有效治疗肾病综合征(Nephrotic syndrome, NS)的经验方，由制首乌、白术、当归、丹参、淮山、山茱萸、川芎、爵床、车前子、泽兰等药物组成，临床及实验研究表明其对NS肾虚夹瘀症有较好的治疗作用[1-3]．为进一步阐明该方的作用机制，建立其主要活性成分的体内分析方法尤为重要．马钱苷是山茱萸的有效成分之一，具有增强机体免疫能力等生理活性[4-5]．阿魏酸是当归和川芎的有效成分之一，具有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗菌消炎、解毒保肝等作用[6-8]．二苯乙烯苷是首乌的有效成分之一，具有抗氧化、调血脂的作用，可延缓或减轻动脉粥样硬化的发生和发展[9-10]．本实验建立了灌胃补肾通络方大鼠体内血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量测定方法，为补肾通络方作用机制的进一步研究奠定分析基础．

1仪器、试剂与材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；MX-S型涡旋仪(北京大龙兴创实验仪器有限公司)；TG-16G高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津恬静奥特赛恩斯仪器有限公司)；AUW220D分析天平(日本Shimadzu公司)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海雅荣生化仪器设备有限公司)．

马钱苷对照品(批号11640-201005，质量分数99.2%)、阿魏酸对照品(批号110773-201012，质量分数99.6%)、二苯乙烯苷(2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄苷)对照品(批号110844-201310，质量分数91%)均购自中国食品药品检定研究院，甲醇、乙酸乙酯为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯．补肾通络方稠浸膏由湖南中医药大学第一附属医院制剂科制备(批号20130406)，含生药10 g/mL．项目组前期研究测定补肾通络方稠浸膏中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷质量浓度分别为2.5147，0.2925，3.1190 g/L[11]．

清洁级近交系雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠，购自湖南中医药大学实验动物中心，体重250±20 g，SPF级动物房标准饲料常规饲养，合格证号为SCXK(湘)2011-0003．

2方法与结果

2.1　对照品溶液的制备

准确称取马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷各10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇匀，制成1.0 g/L的对照品储备液；精密量取适量，用甲醇稀释成系列混合对照品溶液，质量浓度分别为0.05，0.75，1.00，1.50，2.50，5.00，25，50，100和150 mg/L，置于4 ℃冰箱内备用．

2.2　血浆样品的制备及预处理

取雄性SD大鼠6只(250～280 g)，隔夜禁食24 h，自由饮水．将补肾通络方稠浸膏按15 μL/g大鼠灌胃给药，分别于给药前及给药后30 min采血，置涂肝素钠的PCR管中，8 000 r/min，4 ℃下离心10 min，取上清血浆，分装标号，于-20 ℃保存备用．

用微量加样器取150 μL血浆，置于0.5 mL棕色高速离心管中，加入450 μL甲醇-乙酸乙酯(V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1)混合溶液，涡旋1 min，10 000 r/min高速离心10 min，提取两次合并上层有机相，然后加入1.0 mol/L的盐酸25 μL，常温下氮气挥干，残渣准确加入25 μL流动相(V甲醇∶V0.01%乙酸水溶液=30∶70)复溶，涡旋1 min，10 000 r/min 离心5 min，取上清液10 μL进样．

2.3　色谱条件及方法专属性考察

色谱条件：色谱柱：Johnson spherigel(大连江申)C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 流动相：甲醇-0.01%乙酸水溶液梯度洗脱(0~18 min，30%甲醇；18~25 min，30%~45%甲醇；25~30 min，45%~50%甲醇；30~35 min，50%~30%甲醇); 流速：1.0 mL/min; 检测波长： 235 nm(0~18 min)，320 nm(18~32 min)，235 nm(32~35 min)；柱温：30 ℃; 进样量：10 μL．

专属性考察：精密取大鼠空白血浆、大鼠空白加标血浆(相当于马钱苷、阿魏酸及二苯乙烯苷质量浓度2.0 mg/L)和含药血浆各150 μL，按2.2项下血浆样品预处理操作，按2.3项下色谱条件测定．

2.4　标准曲线的绘制及最低检测限和定量限

精密移取大鼠空白血浆147 μL，分别精密加入系列混合对照品溶液3 μL，涡旋混匀1 min，其余按2.2项下血浆样品预处理操作，得到系列质量浓度(0.01，0.02，0.03，0.10，0.50，2.0和3.0 mg/L)的空白加标血浆溶液，每个质量浓度平行制备3份．按2.3项下色谱条件测定，分别以马钱苷、阿魏酸、二苯乙烯苷峰面积(A)与对应进样质量浓度(c)进行线性回归，得马钱苷的回归方程为A=73.1c-0.06,r=0.999，马钱苷血浆质量浓度在0.03~3.00 mg/L线性关系良好；阿魏酸的回归方程为A=215.2c-3.97,r=0.999，阿魏酸血浆质量浓度在0.03~3.00 mg/L线性关系良好；二苯乙烯苷的回归方程为A=34.5c+0.775,r=0.999，二苯乙烯苷血浆质量浓度在0.02~2.00 mg/L线性关系良好．马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的检测限(S/N=3)分别为0.020，0.015，0.010 mg/L，定量限(S/N=10)分别为0.03,0.03,0.02 mg/L．

2.5　精密度试验

精密量取2.1项下的混合对照品溶液适量加入空白血浆，按2.2项下操作，制备低、中、高3种浓度的空白加标血浆样品，每个浓度进样5次，测定日内精密度．重复操作，连续测定3 d，测定日间精密度．结果见表1．

2.6　重复性试验

取空白血浆，按2.2项下方法配制质控样品相当于马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷质量浓度为0.5，1.0，2.0 mg/L的血浆样品各5份，依法测定．得高、中、低质量浓度的RSD: 马钱苷分别为7.5%，6.0%和4.1%，阿魏酸分别为6.8%，5.1%和4.0%，二苯乙烯苷分别为7.8%，5.3%和5.0%．

2.7　回收率试验

根据灌胃后30 min血样中马钱苷、阿魏酸、二苯乙烯苷血药浓度，按2.4项下方法制得高、中、低浓度的血浆质控样品，每个浓度连续进样3次，依法测定，记录峰面积，与未经处理的相同浓度的对照品溶液的峰面积比较，计算加样回收率．结果见表2．

表2　回收率试验结果

2.8　血药浓度测定

取2.2项下制备的含药血浆样品，依法测定，用标准曲线法计算，得马钱苷、阿魏酸、二苯乙烯苷的血药浓度，结果见表3．

表3　样品测定结果(n=6)

3讨论

3.1　色谱条件的优化

考察了多种不同的流动相(甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸盐水溶液，甲醇-乙酸水溶液)组成及流动相比例，最终确定甲醇-0.01%乙酸水溶液(pH=4，阿魏酸的pKa值为4.3，在pH值小于4.3的流动相中主要以阿魏酸分子的形式存在，能延长其在反相色谱柱内的保留时间，使之与血浆样品中内源性物质达到分离)为流动相．在本梯度洗脱条件下，大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸、二苯乙烯苷与血浆中蛋白杂峰、内源性物质、补肾通络方复方的其他成分以及这些成分的体内代谢物和结合性成分均能很好地分离，峰形良好，且出峰时间适宜(保证阿魏酸与二苯乙烯苷达到较好分离的前提下，最迟出峰的二苯乙烯苷保留时间约28 min)．本方法检测限分别为马钱苷0.020 mg/L、阿魏酸0.015 mg/L、二苯乙烯苷0.010 mg/L，日内、日间精密度均小于或等于10%，重复性好，符合体内药物浓度测定的要求．

3.2　血浆样品预处理方法的优化

在预试验中对血浆样品的处理方法进行了优化，比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醇对血浆样品中马钱苷、阿魏酸、二苯乙烯苷的提取效果，同时也考察了不同体积比提取溶剂对目标成分的提取效果．最终采用甲醇-乙酸乙酯(V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1)混合溶剂提取，样品与提取溶剂比为V血浆样品∶V甲醇∶V乙酸乙酯=1∶3∶1，操作简便，满足3种分析成分同时提取测定的要求．

血浆预处理过程如果不加1.0 mol/L盐酸，则检测不到阿魏酸的色谱峰，这可能是由于阿魏酸发生离子化，不易进入有机相，加盐酸酸化可以使阿魏酸游离．

由于阿魏酸及二苯乙烯苷见光不稳定，故采用避光操作，所用样品容器均为棕色．

考虑到药动学研究中动物实验的采血量有限、样品量较小，本实验均为微量操作，马钱苷、阿魏酸提取回收率大于74%，二苯乙烯苷由于具有酚醚结构，在酸性条件下提取及测定有部分损失，提取回收率也超过58%，满足血药浓度的测定要求．

本实验建立了灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量的同时测定方法，为进一步开展其主要有效成分在动物体内的药动学研究提供参考．

参考文献：

[1]皮亦华,金红,卢岳华,等. 补肾通络方治疗大鼠C-BSA膜性肾炎的药效学研究[J]. 湖南师范大学学报: 医学版, 2006,3(4):4-8.

[2]卢岳华,陈小光,金红,等. 补肾通络方治疗肾病综合征的临床观察[J]. 湖南中医药大学学报, 2007,27(6):47-49.

[3]WANG B H, PI Y H, LU Y H,etal. Effect of Bushen Tongluo Fang on hypercoagulable state in rats with experimental membranous glomerulonephritis induced by cationized bovine serum albumin[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2009,40(7):1095-1098.

[4]纪瑞锋,刘素香,王文倩,等. 忍冬属植物环烯醚萜类成分研究概况[J]. 中草药, 2012,43(6):1226-1232.

[5]魏惠珍,邱伟华,饶毅,等. HPLC法测定六味地黄片中马钱苷和丹皮酚[J]. 中草药, 2010,41(3):405-407.

[6]金红,李雅,凌晓,等. 健康大鼠服用益神通络方后血清中阿魏酸的RP-HPLC测定[J]. 湖南师范大学学报:医学版, 2007,4(4):9-13.

[7]赵东平,杨文钰,陈兴福,等. 阿魏酸的研究进展[J]. 时珍国医国药, 2008,19(8):1839-1842.

[8]汤浩,高庆剑,陆铖,等. 阿魏酸和异阿魏酸对HepG2细胞增殖及其细胞色素P450酶的影响[J]. 中草药, 2014,45(12):1726-1730.

[9]WANG C Y, ZHANG L T, YUAN Z F,etal. Blood lipid regulation of ethyl acetate extracting fraction and stilbene glycoside from tuber of Polygonum multiflorum [J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2008,39(1):78-83.

[10]XIANG K, LIU G, ZHOU Y J,etal. 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside (THSG) attenuates human platelet aggregation, secretion and spreading in vitro[J]. Thromb Res, 2014,133(2):211-217.

[11]刘湘丹,黄攀,卢岳华,等. HPLC法同时测定补肾通络方中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量[J]. 中国药房, 2014,25(47):4455-4457.

(编辑杨春明)

*通讯作者,E-mail：lyh@hunnu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21275052，21175042)；湖南省高校科技创新团队支持计划资助项目；湖南省教育厅/财政厅重点资助项目(12A098)；湖南省大学生创新性实验计划项目(2013-176)

收稿日期：2014-12-27

中图分类号R284.1

文献标识码A

文章编号1000-2537(2015)03-0053-05

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.03.010