肾去交感支配对心肌梗死后大鼠心肌纤维化和转化生长因子-β1的影响

郑晓新 侯果 邱璇 蒋学俊

基础研究

肾去交感支配对心肌梗死后大鼠心肌纤维化和转化生长因子-β1的影响

郑晓新 侯果 邱璇 蒋学俊

目的 探讨肾去交感神经术（RSD）对心肌梗死大鼠心肌纤维化和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达水平的影响。方法 52只雄性SD大鼠随机分为4组：正常对照组（Control组）、肾去交感组（RSD组）、心肌梗死组（MI7d+Sham组）和肾去交感干预组（MI7d+RSD组）。MI7d+Sham组和MI7d+RSD组分别给予前降支冠脉结扎术制备心梗模型，7 d后行肾交感假手术或去交感术。心脏彩超评估大鼠左心室收缩末期直径（LVESD）、左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。Masson法检测大鼠左心室心肌胶原容积分数（CVF）。RT-PCR法和Western-blot法分别检测大鼠左室心肌TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。结果 与MI7d+Sham组相比，MI7d+RSD组大鼠LVESD明显减小［LVESD（3.13±0.25）mm比（5.23±0.15）mm，P＜0．01］，而 LVFS 和 LVEF 均增高［LVFS（38.2±4.5）%比（23.1±3.3）%，P＜0．01；LVEF（61.7±1.3）%比（40.4±2.7）%，P＜0．01］。与 MI7d+Sham 组相比，MI7d+RSD 组胶原容积分数减少［（42.66±7.55）%比（59.33±9.79）%，P＜0．01］，TGF-β1 mRNA（1.47±0.09 比 2.00±0.09，P＜0.01) 和 TGF-β1 蛋白（0.46±0.04 比0.73±0.02，P＜0．01）的相对表达量均减少。结论 肾去交感神经术能抑制心肌梗死大鼠心肌纤维化并改善心功能，可能与下调TGF-β1的表达有关。

肾去交感支配； 心肌梗死；心肌纤维化； 转化生长因子-β1

心肌梗死（myocardial fibrosis，MI）导致的心力衰竭死亡率较高[1]，主要发病机制之一为心肌病理性重构，表现为心肌间质纤维化、心肌细胞肥大和凋亡，最主要的是间质纤维化。心肌纤维化主要特点是心肌细胞外基质沉积，如胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、弹力蛋白等，导致心脏僵硬度增加，最终影响心脏收缩和舒张功能[2]。交感神经系统（sympathetic nervous system，SNS）及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（rennin-angiotensin-aldosterong system，RASS）的过度激活是导致心肌纤维化和心室重构的重要因素[3]。

肾脏和心脏组织在全身交感激活后释放的去甲肾上腺素占总量的50%以上，提示肾脏交感神经激活在全身交感神经兴奋中的重要作用。肾交感激活后，肾脏传入神经可诱导包括心脏、中枢神经和其他脏器交感神经激活，进一步导致去甲肾上腺素释放增加、RASS系统激活[4]。据此推测，肾脏交感神经激活在心肌梗死后心肌纤维化的发生发展中至关重要。

肾去交感术（renal sympathetic denervation，RSD）主要原理是去除肾动静脉周围的传入和传出神经，通过下丘脑中枢神经反馈机制，有效降低病理状态下的全身交感活性[5]。SYMPLICITY HTN系列研究表明，RSD在难治性高血压治疗方面有一定作用[6]。而Reach-pilot实验则提示，RSD可明显改善心衰患者的心功能[7]。以上作用均可能与抑制交感系统过度激活相关。此外，RSD用于治疗慢性交感神经激活引起的相关心血管疾病，如心肌梗死后心脏重塑、心力衰竭左心室肥厚等有较大潜力[8]。目前RSD对心肌梗死后心肌纤维化的影响及其作用机制尚不清楚，本实验通过心肌梗死大鼠模型来探讨该问题，为RSD治疗心梗后心肌纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 60只成年雄性SD大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物中心，体重180～200 g，饲养于自然光暗环境，室温为（23±2）℃，标准条件饲养动物。所有有关动物操作方法均遵守武汉大学动物伦理委员会规程。

1.2 实验分组 大鼠随机分为4组：Control组（n=10）、RSD 组 （n=12）、MI7d+Sham 组 （n=15）和MI7d+RSD组（n=15）。Control组大鼠不做任何处理；RSD组大鼠给予肾动静脉去交感处理；MI7d+Sham组和MI7d+RSD组大鼠分别给予前降支冠脉结扎术制备心梗模型，7 d后行肾动静脉去交感假手术和去交感术处理。

1.3 肾去交感模型的建立 造模前腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉动物，备皮，消毒，铺巾。参照Hu等[9]的方法，分离肾动静脉，解剖显微镜下（×25）离断所有可见的神经纤维，并用10%苯酚乙醇溶液涂抹肾动静脉，充分去除肾交感。采用肾神经电刺激的方法评估是否彻底去除肾交感神经。术中严格无菌操作，术后青霉素8万U/d腹腔注射，连用3 d，预防感染。

1.4 心肌梗死模型的构建 造模前腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉动物，手术期间气管插管呼吸机辅助呼吸。备皮，消毒，铺巾，沿胸骨左缘在第4～5肋间做一纵向切口，在距前降支开口处2～3 mm处用6号线结扎冠脉，心梗区域变苍白，心跳减弱。缝合伤口，动物复苏后每天肌注40万U青霉素，连续3 d，预防感染。

1.5 超声多普勒测定 心肌梗死造模结束4周后，应用多普勒超声分别测量各实验组大鼠心脏左心室收缩末期直径（LVESD）、左室短轴缩短率（LVFS）和左室射血分数（LVEF）。

1.6 心肌胶原容积分数（collague volume fraction，CVF）测定 超声检查后，过量麻醉安乐死处死动物，分离左心室并在垂直于长轴中点处将左室分成两部分，心底部立即放置于-80℃冰箱用于生化分析，心尖部置入10%甲醛固定，用于行Masson染色。采用Image-pro plus分析软件计算心肌胶原体积分数（CVF）。CVF=胶原纤维面积/视野总面积。每张切片选取5个视野，计算平均值。

1.7 RT-PCR检测心肌组织中TGF-β1的mRNA表达水平 从GenBank中查阅基因序列，根据引物设计原则，利用Primer 5.0软件引物设计。TGF-β1引物上游序列：5′-CACTCCCGTGGCTTCTAGTG-3′，下游序列 5′-GGACTGGCGAGCCTTAGTTT-3′，退火温度为58℃。PCR产物经过含0.5 mg/L Goldview的2%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪照相，采用Quantity Onev4.6.2软件定量分析，以目的基因吸光度（A）与内参GAPDH的比值表示其表达水平。

1.8 Western-blot法检测心肌组织TGF-β1蛋白表达 按照Limana等[10]的方法提取心肌组织总蛋白。取含50 g总蛋白的样品进行非连续SDSPAGE电泳分离蛋白，并将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭，一抗孵育过夜、漂洗。辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在37℃下孵育3 h，洗膜，加入电化学发光液（ECL）底物并曝光，图像分析系统半定量分析，GAPDH作为参照，计算各组样品蛋白相对表达水平。

1.9 统计学方法 采用SPSS 13．0软件进行统计分析。所有数据均以±s表示，对所有数据进行方差齐性和正态性检验，多组间数据比较采用方差分析，两两数据比较采用SNK-q检验。以P＜0．05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组动物基本情况 Control组大鼠全部存活，RSD组大鼠死亡3只，MI7d+Sham组大鼠死亡5只，MI7d+RSD组大鼠死亡6只，死亡原因考虑主要为严重心力衰竭、术后出血或感染。余下动物存活至实验终点。

2.2 各实验组大鼠超声检测结果 与RSD组相比，MI7d+Sham组心功能下降，表现在LVESD值增加，LVFS、LVEF 值降低［LVESD（5.23±0.15）mm 比（2.20±0.20）mm，P＜0．01；LVFS（23.1±3.3）%比（48.3±4.3）%，P＜0．01；LVEF（40.4±2.7）%比（75.2±2.6）%，P＜0．01］。与 MI7d+Sham 组相比，MI7d+RSD 组心功能改善，LVESD 值减小［（3.13±0.25）mm 比（5.2±0.15）mm，P＜0．01］，LVFS、LVEF 值增加［LVFS（38.2±4.5）%比（23.1±3.3）%，P＜0．01；LVEF（61.7±1.3）%比（40.4±2.7）%，P＜0．01］。见图 1。

2.3 各实验组大鼠心肌组织Masson染色及CVF检测结果 正常心肌组织呈红色，纤维化组织呈蓝色。Control组及RSD组心肌无明显胶原沉积，MI7d+Sham组大鼠Masson染色蓝染面积较RSD组显著增加［（59.33±9.79）%比（4.62±0.23）%，P＜0．01］，RSD 干预后（MI7d+RSD 组）显著减少这种增加趋势 ［（42.66±7.55）%比 （59.33±9.79）%，P＜0．01］。见图 2。

2.4 各实验组大鼠心肌组织TGF-β1 mRNA表达情况 与 RSD组比较，MI7d+Sham组 TGF-β1 mRNA的相对表达量明显升高（2.00±0.09比0.99±0.12，P＜0．01)；与 MI7d+Sham 组比较，MI7d+RSD 组TGF-β1 mRNA相对表达量减少（1.47±0.09比2.00±0.09，P＜0．01）。见图 3。

2.5 Western-blot法检测大鼠心肌组织TGF-β1的表达水平 与RSD组比较，MI7d+Sham组TGF-β1表达水平明显升高（0.73±0.02 比 0.29±0.02，P＜0．01）；与 MI7d+Sham 组比较，MI7d+RSD 组 TGF-β1蛋白表达水平显著下降（0.46±0.04比 0.73±0.02，P＜0．01）。见图 4。

3 讨论

心肌梗死后，以交感神经系统及RASS系统的激活为病理生理特征，通过增加左心室负荷影响心功能。心衰早期心脏排出量不足时，机体会启动神经内分泌机制代偿，以维持心排出量及重要脏器的灌注压[11]。然而，长期交感神经兴奋必然会增加肾素水平、增加肾血管阻力引起左心室肥厚和心肌纤维化等一系列负面变化，出现心功能不全及恶性心律失常[12]。肾脏交感神经激活与心肌梗死所致的心力衰竭时的水钠潴留相关，且能促进心梗后心衰的发展，阻断交感神经系统的激活对心力衰竭的治疗是一个有价值的方法[13]。抑制交感神经系统和RASS系统的过度激活是近年来治疗的重要方向。研究显示，RSD明显增加心衰患者的6 min步行距离[7]。Clayton等[14]的研究表明，RSD可有效降低兔心衰模型血浆BNP水平。

本实验分别通过结扎冠脉前降支和肾血管化学消融法构建心肌梗死和肾去交感神经动物模型，采用心脏超声、RT-PCR及western-blot等方法，研究RSD对心肌梗死大鼠心功能及心肌纤维化的影响，探讨其在心肌梗死大鼠心肌纤维化中的作用，以期为心肌梗死后心功能的改善及延缓/逆转心肌纤维化和改善心室重构寻找新的治疗靶点。

目前构建RSD模型的方法主要有化学消融法及经导管介入射频消融法。研究显示，这两种方法均能明显降低肾去甲肾上腺素溢出，并可降低肾交感神经活性。本实验采用手术剥离肾动脉和静脉外膜交感神经，再涂抹苯酚，直接损伤神经纤维达到去肾交感支配的目的，构建RSD模型。术后采用电刺激神经的方法来验证去肾交感神经是否成功。肾神经影响肾血流动力学，去肾交感前，直接电刺激肾神经干近端10～30 s会引起肾血管收缩，同时引起心率和血压的波动［心率加快8～15次/min，收缩压上升 5～10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）］，肾脏变苍白，而去肾交感支配后，上述一系列反应消失，提示去肾交感神经造模成功。本实验中，RSD是在建立心梗模型后7 d进行，此时心梗大鼠交感兴奋开始逐渐减弱，从大鼠存活率方面考虑，心梗造模即刻及术后第1周内，其对麻醉及手术操作的耐受均较差，且麻醉和手术本身可能影响心功能，故综合以上两个因素，选择心梗后第7 d作为RSD手术时间点。

本实验采用结扎前降支的方法构建大鼠心肌梗死模型，心梗后心肌细胞出现坏死、纤维化，导致心肌病理性重构，为研究心梗后病理生理变化通用的动物模型。本研究建立大鼠心肌梗死模型后行超声多普勒检查和心肌组织Masson染色，可见心肌梗死组（MI7d+Sham组）较正常对照组和去交感组（Control组和RSD组）心功能明显下降且出现心肌纤维化，提示心肌梗死造模成功（图1，图2）。本实验心肌梗死RSD治疗组（MI7d+RSD组）较心肌梗死组（MI7d+Sham组）心功能指标LVESD降低，LVFS和LVEF值增高，表明RSD可改善心肌梗死大鼠心功能（图1）。心肌梗死后发生心肌重塑，而心肌纤维化是其重要发生机制，心肌纤维化不但加重心肌梗死后心肌缺血缺氧，增加室壁僵硬度，且降低室壁顺应性，影响舒张期心室充盈，并会影响心肌细胞之间力的产生和传递，使部分心室肌组织丧失收缩功能，加重心功能损害。从本实验Masson染色结果看，相比RSD组，心肌梗死模型组（MI7d+Sham组）心肌间质胶原纤维显著增加，而肾去交感干预组（MI7d+RSD组）的CVF较MI7d+Sham组降低（图2），表明RSD可抑制心肌梗死大鼠心肌纤维化，为改善心功能提供理论依据。

心肌纤维化时，除表现为胶原含量增加外，TGF-β1等细胞因子的浓度也会发生变化，并参与纤维化的发生、发展。研究证实，TGF-β1是一种促纤维化蛋白因子，可促进缺血后细胞增殖及胞外基质重构，诱导心肌纤维化，导致心功能不全。成纤维细胞基质金属蛋白酶（fibroblast matrix metalloproteinases，MMPs）可促进心脏成纤维细胞增殖和迁移，促进胶原沉积和抑制间质胶原酶诱导心室纤维化，而金属基质蛋白酶组织抑制因子1（Tissue inhibitors of metalloproteinase 1，TIMP1）可调节 MMPs水平和活性。Stawowy等[15]证实，TGF-β1可上调MMPs水平并提高活性，影响MMPs/TIMP1的平衡，导致心梗后心肌纤维化，最终引起心室变薄、心功能失代偿。心肌梗死后交感神经激活，不仅通过增加去甲肾上腺素释放促进成纤维细胞合成TGF-β1，而且通过刺激RAAS促进TGF-β1的合成[16]。TGF-β1可直接作用于心肌细胞、成纤维细胞，引起心肌肥厚及胞外基质沉积，加快心肌纤维化进程[17]。

从本实验RT-PCR结果看，与MI组相比，MI7d+RSD组心肌组织TGF-β1 mRNA的相对表达量明显降低（图3）。从western-blot结果看，正常对照组（Control组）和RSD组大鼠心肌组织中TGF-β1蛋白未见明显阳性表达，而MI组表达量明显增加，MI7d+RSD组能明显减少这种增加趋势（图4），推测TGF-β1参与大鼠心肌梗死后心肌纤维化过程，很好解释了本研究Masson染色结果，并且与既往相关报道相符。

综上所述，本研究探讨了RSD对心梗大鼠心功能、心肌纤维化的影响及其可能的发生机制。肾去交感支配可以改善心肌梗死后大鼠心功能，并延缓心梗后心肌纤维化的发生发展，可能与抑制TGF-β1的表达有关。由于存在肾交感神经再生可能，尚需观察长期实验效果或必要时再次RSD处理。另外，RSD对局部和全身交感系统以及RAAS系统的影响及相关具体机制尚有待深入研究。

（本文图片第863、864页）

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Effect of renal sympathetic denervation on myocardial fibrosis and the expression of TGF-β1 in rats with myocardial infarction

ZHENG Xiao-xin，HOU Guo，QIU Xuan，et al.Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiology，Cardiovascular Research Institute，Wuhan 430060，China

Objective To observe the effect of renal sympathetic denervation（RSD）on myocardial fibrosis and the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）in myocardial infarction（MI）rats．Methods 52 SPF level SD rats were randomly divided into four groups，control group，RSD group，MI7d+Sham group and MI7d+RSD group．Bilateral renal sympathectomy or sham operation were performed in RSD group and MI7d+RSD group or MI7d+Sham group，separately.Ultrasound was adopted to evaluate the changes of left ventricular endsystolic diameter（LVESD），left ventricular fractional shortening（LVFS） and left ventricular ejection fraction（LVEF）．Masson staining was used to measure the collagen volume fraction（CVF）．RT-PCR and western-blot methods for the detection of myocardial mRNA and protein expression levels of TGF-β1，respectively．Results LVESD was lower in MI7d+RSD group than those in MI7d+Sham group，and LVFS and LVEF were higher［LVESD（3.13±0.25）mm vs （5.23±0.15）mm，P＜0．01，LVFS（38.2±4.5）%vs （23.1±3.3）%，P＜0．01，LVEF（61.7±1.3）%vs （40.4±2.7）%，P＜0．01］．Compared with MI7d+Sham group，CVF was lower in MI7d+RSD group［（42.66±7.55）%vs （59.33±9.79）%，P＜0．01］，and the relative expression of TGF-β1 mRNA was lower than that in MI7d+Sham group（1.47±0.09 vs 2.00±0.09，P＜0．01），and the relative expression of TGF-β1 protein was lower than that in MI group（0.46±0.04 vs 0.73±0.02，P＜0．01）．Conclusion Renal sympathetic denervation can inhibit myocardial fibrosis in rats post-MI and improve heart function，which may be achieved by inhibiting theexpression of myocardial TGF-β1.

Renal sympathetic denervation； Myocardial infarction； Myocardial fibrosis； Transfer growth factor-β1

JIANG Xue-jun，E-mail：xjjiang@whu.edu.cn

中央高校专项科研项目基金（项目编号：2042015kf0074）

430060 湖北省武汉市，武汉大学人民医院心血管内科，心血管病湖北省重点实验室，武汉大学心血管病研究所

蒋学俊，E-mail：xjjiang@whu.edu.cn

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．09．021

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）09-0845-05

2016-04-13）