缺血性卒中不同亚型的血浆标志物研究进展

王源，潘旭东

缺血性卒中是卒中最常见的形式，按照急性卒中治疗低分子肝素试验病因分型法（The Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分为大动脉粥样硬化型卒中（large artery atherosclerotic，LAA），小动脉闭塞型卒中（small artery occlusion，SAO），心源性栓塞（cardioembolism，CE），其他原因的急性卒中（stroke of other determined etiology，SOE）和原因未明的卒中（stroke of undetermined etiology，SUE）[1]。卒中的发病原因复杂，亚型的重要价值在于区分不同发病原因，提出不同的治疗方案，提高治疗效果和预后。目前较为公认的LAA型卒中主要由动脉粥样硬化继发动脉闭塞或狭窄导致的，SAO型卒中主要由小动脉的玻璃样变、脂质变性和小动脉硬化导致，CE型卒中由心源性栓子导致。

近年不断有新的分型提出，针对TOAST分型的不足做改进，但病因亚型的核心没有改变，并且这些新的分型仍有不足。在现阶段，TOAST病因分型仍为最重要的分型。

缺血性卒中的诊断主要依靠颅脑计算机断层扫描（computed tomography，CT）或磁共振做出。要做好亚型分类首先需要脑血管的显像检查，包括磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、CT血管造影（CT angiography，CTA）、数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）、颅脑超声，还需要做心脏超声等。但在临床实践中发现，即使脑血管显像检查和心脏检查完善，仍有部分患者无法做出准确亚型分类，比如大动脉粥样硬化和小动脉闭塞并存，确定此次发病的亚型困难，对治疗方案制订造成影响；合并存在心房颤动和大动脉狭窄应被列入病因未明亚型，对治疗和预后判断也造成困难。此外，由于两种亚型的病因并存情况较多，造成病因未明亚型比例过高，对治疗和预后造成不利影响，需要新的技术手段对亚型给予区分。近年来，有些技术正在引起关注，其中卒中相关血浆标志物的检测日益增多，为反映不同亚型的病因和发病机制、探讨患者的预后，从而进一步指导临床治疗及二级预防提供了新的依据，下面将该领域的进展做一综述。

1 LAA型卒中的相关血浆标志物

LAA型卒中是缺血性卒中最常见的类型，约占全部脑梗死的60%，是在各种原因的基础上，脑动脉主干或分支动脉管腔狭窄超过50%、闭塞，引起脑局部血流减少或中断，使脑组织缺血、缺氧性坏死，出现局灶性神经系统症状和体征[1]。目前认为动脉粥样硬化为此型脑梗死的基本原因，与动脉粥样硬化相关的血浆标志物有以下几种。

1.1 微小核糖核酸 微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类由21～25个核苷酸组成的单链非编码小RNA，主要通过与靶mRNA 3’非翻译区（3’untranslated region，3’UTR）不完全互补配对的方式在转录后水平负向调控靶mRNA表达，最终导致mRNA降解或翻译抑制[2]。

已有研究证实，miRNAs能以稳定的形式存在于人体血浆中[3]。既往研究显示，miRNAs在血管内皮细胞炎症和衰老，血管平滑肌细胞增生，血管完整性维持及胆固醇代谢等过程中发挥调控作用，并且在神经元损伤及缺血性卒中发病过程中也起到重要调控作用[4-8]。

Hergenreider等[9]研究显示，miR-143在正常动脉的平滑肌细胞中高表达，在血管受损后表达下调，对患有动脉粥样硬化的小鼠注射miR-143微泡，能减少小鼠体内动脉粥样硬化病变的形成。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）能够介导内皮细胞的凋亡进而参与血管慢性炎症反应，靶基因预测结果显示TNF-α是miRNA-23a的靶基因之一，Ruan等[10]研究表明miR-23a通过caspase-7的丝氨酸/苏氨酸激酶4-caspase-3的途径调节TNF-α介导的内皮细胞凋亡。动脉粥样硬化是动脉壁对血管内皮细胞损伤的一种慢性炎症过程，血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）介导内皮细胞损伤后的黏附过程，生物学功能分析显示VCAM-1是miR-126的潜在靶点之一。因此miRNA-126可能通过调节VCAM-1的表达参与血管炎症的形成，Long等[11]的研究表明，miRNA-126可作为缺血性卒中潜在的标志物。

本课题组采用高通量测序技术对人类血浆miRNAs表达谱也进行了研究，研究结果表明，LAA型卒中患者及SAO型卒中患者血浆miRNAs表达谱存在明显差异，提示miRNAs可能通过靶基因在LAA及SAO的发病过程中发挥不同的调节作用[12-13]。此外本课题组对存在差异表达的部分miRNAs进行了实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）验证及生物信息学分析，研究表明，血浆中miRNA-146b和miRNA-23a水平在LAA型脑梗死组显著降低且与病情的严重程度呈负相关，提示二者可作为LAA型脑梗死的急性期血浆标志物，并有助于判断病情的严重程度[14]；miR-143、miR-126与脑动脉粥样硬化的广泛程度相关，且受脑梗死影响较小，可考虑作为脑动脉粥样硬化的血浆标志物[15]。

目前，miRNA与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的相关研究尚处于初期阶段，两者的关系有待于进一步阐明，这可能会成为新的研究领域，为LAA型卒中的诊疗带来益处。

1.2 骨保护素 骨保护素（osteoprotegerin，OPG）是1997年Tsuda等在人胚胎肺纤维细胞中发现的一种分泌蛋白，是肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族的一员，具有调节骨密度的作用。在随后的更多研究中，OPG与心血管疾病的关系越来越被重视，它可保护血管内皮细胞、抑制血管钙化和动脉粥样硬化，在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要的调节作用。

到目前为止，已有许多关于OPG和动脉粥样硬化的研究，OPG对动脉粥样硬化介导作用的机制正在慢慢被揭开。Golledge等[16]的研究发现，细胞间黏附分子随着OPG与肿瘤坏死因子的浓度增加而增加，单核细胞结合在这些黏附分子上，随着它们进入血管内膜，这是动脉发生粥样硬化的关键步骤之一。斑块内炎性细胞及其炎性产物可能是造成斑块不稳定、斑块破裂的促发因素。巨噬细胞是构成不稳定斑块的主要细胞。不稳定斑块处OPG水平升高，T淋巴细胞表达核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）增多，单核细胞分泌RANK增多。Sandberg等[17]对100例胸痛患者进行血浆OPG分析，发现与稳定型心绞痛患者及正常对照组相比，不稳定型心绞痛患者的血清OPG水平明显升高。该研究同时发现，在经过冠状动脉介入治疗（这是一种医源性斑块破裂）的患者，外周血单核细胞可表达更多的RANKL。RANKL可促使单核巨噬细胞聚集与浸润，并由此使粥样斑块中平滑肌骨化，可增加不稳定型心绞痛患者基质金属蛋白酶在血管平滑肌中的活性，使细胞浸润、粥样斑块生长。OPG可通过竞争RANK与RANKL结合，从而抑制基质金属蛋白酶在血管平滑肌中的活性。同时OPG和RANKL结合可抑制血清RANKL的清除，稳定RANKL水平。这个研究还发现了蛋白酶似乎在动脉粥样硬化斑块基质降解中起了关键作用，使其容易破裂。

本课题组采用酶联免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）测定血浆OPG、sRANKL水平，比较三组间血浆OPG、sRANKL水平；同时为评价LAA组患者脑动脉粥样硬化广泛程度，将LAA组分为单支、双支、多支病变3个亚组，评价OPG、sRANKL、OPG/sRANKL比值与AS广泛程度的相关性。对LAA组患者随访3个月，结合mRS评分，应用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估OPG、sRANKL、OPG/sRANKL比值对预后的预测价值。研究结果表明血浆OPG、sRANKL水平与LAA型卒中的发病、AS病变广泛程度及预后有关；可作为评价LAA型卒中的发病及AS病变广泛程度的血浆标志物；尤其是OPG/sRANKL比值有助于评估AS广泛程度和判断预后[18]。

1.3 S-100B蛋白 S-100蛋白是一种酸性钙结合蛋白，相对分子质量21 000 Da，主要存在于中枢神经系统各部位的星状神经胶质细胞的细胞液中，因其在饱和硫酸铵中能够100%溶解而得名。S-100蛋白由α和β两种亚基组成3种不同的形式，即S-100αα、S-100ββ、S-100αβ，其中S-100ββ、S-100αβ统称为S-100B蛋白。S-100B蛋白主要存在于神经胶质细胞和神经膜细胞中。星形胶质细胞作为大脑中最丰富的胶质细胞，其末梢参与组成完整的血脑屏障，当中枢神经系统细胞损伤时，缺血区星形胶质细胞通过凋亡和坏死两种方式死亡，S-100B蛋白从细胞液中释放，并且血脑屏障的破坏在早期再灌注时，可使原来存在于局部缺血梗死核心区的大量S-100B蛋白释放入血液，因此，外周血中S-100B蛋白作为一种特异性脑源性蛋白，是中枢神经系统损伤的特异和敏感的生物标志物。较早的研究均发现，急性缺血性卒中（acute cerebral ischemic stroke，AIS）时S-100B蛋白水平显著增高，对AIS的诊断和预后有重要意义[19]。近期的研究结果也显示，S-100B蛋白参与的生物标志物组合，早期诊断AIS显示出较高的敏感度和特异性[20]。但Dassan等[21]也指出，虽然S-100B蛋白主要存在于中枢神经系统，但因黑色素瘤、肌上皮细胞、软骨细胞、脂肪细胞等也可表达S-100B蛋白，在缺血性卒中时不能排除神经系统以外的因素使S-100B蛋白升高的可能性，其得出的结论是：应用S-100B蛋白早期诊断缺血性卒中特异性低，在卒中急性期S-100B蛋白并没有迅速出现明显升高，在症状出现24 h后开始升高，峰值出现在第3天。临床上尚无健康人群的外周血或脑脊液S-100B蛋白正常值的统一标准，这也造成了各项试验中对S-100B蛋白的评估标准不统一。对于S-100B蛋白的应用价值，有待进一步深入研究。

1.4 妊娠相关血浆蛋白A 妊娠相关血浆蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）是一种锌离子结合的金属蛋白酶，由不稳定性斑块中的各种活化细胞产生并释放到细胞外基质中。PAPP-A在腐蚀和破裂的冠状动脉及颈动脉斑块纤维帽肩部的单核-巨噬细胞中大量表达，而在稳定性斑块中极少表达。PAPP-A还是一种特异的胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）激动剂，使活化的IGF-1结合到细胞表面1型IGF受体，IGF-1能诱导细胞增殖、分化和迁移，激活炎症细胞，促进斑块的发展和去稳定性。Sangiorgi等[22]提出PAPP-A是颈动脉斑块去稳定性和破裂的一个标志物，并且有可能成为脑血管事件危险分层的一个新靶点。既往研究中，稳定性斑块组与不稳定性斑块组、稳定性斑块组与不稳定性破裂斑块组之间、不稳定性斑块未破裂组与不稳定性破裂斑块组之间血清PAPP-A水平差异均具有显著性，而稳定性斑块组与不稳定性斑块未破裂组之间差异无显著性，血清PAPP-A水平与斑块易损程度呈正相关关系[23]。表明PAPP-A可能与颈动脉斑块的去稳定和破裂相关，特别是与破裂关系可能更加密切。

1.5 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一组Zn2+、Ca2+依赖性蛋白酶，其主要功能是降解和重构细胞外基质。迄今为止，已发现20多种MMPs家族成员，按其分子结构及底物的不同可分为明胶酶（MMP-2、MMP-9），胶原酶（MMP-1、MMP-8），基质溶解酶（MMP-3、MMP-7、MMP-10），膜型基质蛋白酶和其他不能分类的基质酶5类。正常状态下，MMPs被控制在较低水平，但在一些病理条件下，其活性显著增加，参与组织的损伤与修复。在缺血的早期，内皮细胞屏障即受损，导致水分子和其他小分子物质渗出，此时，基膜层的屏障作用也被破坏，而MMPs系统是参与细胞外基质降解和重构的重要因子，尤其是MMP-9含有纤维蛋白结合区域，可以特异性攻击层蛋白、纤连蛋白等，与细胞外基质的降解关系最为密切。既往国内外的许多临床研究也证实，AIS患者血清MMP-9水平在超早期即出现显著升高，因此可应用于早期辅助诊断AIS[24]。Ramos等[25]对22项相关研究、3289例AIS患者进行回顾性研究分析，指出与对照组相比，MMP-9在缺血性卒中急性期即出现显著升高，并与梗死范围、梗死严重程度及预后损伤程度显著相关。各项相关研究结果均提示，MMP-9作为辅助诊断AIS的生物标志物具有很大的临床应用潜力。

1.6 可溶性CD40配基 CD40和CD40L（CDl54）均为肿瘤坏死因子超家族成员，由参与AS形成的主要细胞共同产生，两者之间的相互作用增加了各种促AS因子的表达，如各种黏附分子、化学因子、细胞因子、生长因子和MMP。Zirlik等[26]用低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受体缺陷小鼠证实，CD40是粥样斑块发展的重要信号，阻断CD40能抑制AS病变的进展；当斑块破裂诱导血小板活化时，则会导致斑块表面CD40L表达增加，从而介导血管壁内炎症级联反应，激活内皮细胞，促进血液凝固，最终导致急性脑缺血事件的发生和发展。Hocher等[27]的研究表明，与对照组相比，急性缺血性卒中患者血小板表面sCD40和单核细胞表面CD40表达显著增加，说明两者可能参与了易损斑块的形成和血栓形成事件的发生。

2 SAO型卒中的相关血浆标志物

SAO型卒中是指大脑半球或脑干深部的小穿通动脉，在长期高血压的基础上，血管壁发生病变，导致管腔闭塞，形成小的梗死灶。目前认为病因主要与高血压引起的脑部小动脉玻璃样变、动脉硬化性病变及纤维素样坏死等有关。

2.1 miRNA SAO型卒中发病的病因主要与高血压引起的脑部小动脉玻璃样变、动脉硬化性病变及纤维素样坏死等有关。近年来，已有研究表明高血压发病的机制受到miRNAs目的基因的调控，众所周知，肾素-血管紧张素-醛固酮系统在血压升高过程中起到重要作用。已有研究表明血管紧张素Ⅱ 1型受体（angiotensinⅡ type 1 receptor，AT1R）和miR-155在内皮细胞和血管平滑肌细胞共同表达，miR-155可在翻译水平抑制AT1R表达[28]。另外，用转化生长因子-β1处理原代培养的人肺成纤维细胞能使miR-155表达下调，而TNF-α仅和干扰素-β可诱导巨噬细胞表达miR-155，造成炎症过程中性粒细胞/单核细胞增多。因此，miR-155可能是炎性介质的靶点和调节淋巴细胞和骨髓细胞功能的靶点。业已证实，缺血性脑损伤后，脑组织和血液中miR-155表达水平均显著下调[29]。

本课题组通过高通量测序在LAA型及SAO型脑梗死的差异表达的miRNAs进行了进一步荧光定量PCR验证及生物学功能分析，结果表明，miRNA-451a在SAO型患者血浆中表达显著下调，miR-320a、miR-99b、miR-127在SAO型患者血浆中表达显著上调，提示miRNA-451a、miR-320a、miR-99b、miR-127可作为SAO型脑梗死的急性期血浆标志物[14]。

2.2 α2巨球蛋白 α2巨球蛋白（α2-macroglobulin，α2-MG）是一种蛋白酶抑制物，通过中和血纤维蛋白溶解酶、纤溶酶原激活物和金属蛋白酶促进凝血。此外，α2-MG被认为是白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的载体蛋白而参与炎症反应。已有研究表明α2-MG在急性卒中患者的血浆中含量高于正常人，并且差异具有显著性，提示α2-MG可能作为急性脑血管疾病的生物标志物[30]。此外，该研究认为α2-MG水平与脑白质病变有关，可能反映出慢性脑小血管疾病的病理生理过程。

本课题组应用酶联免疫吸附测定法对LAA型卒中、SAO型卒中及健康对照患者血浆α2-MG浓度进行了测定。研究结果表明α2-MG水平可考虑作为诊断SAO的血浆标志物，是SAO的独立危险因素，且与脑部白质损害程度密切相关[31]。

2.3 细胞间黏附分子-1 细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）又叫作CD54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成员，是介导黏附反应重要的一个黏附分子。ICAM-1在静息的血管内皮细胞上呈低水平表达，通过与血管内皮细胞表面上的特异性受体结合而发挥其生物学活性。作为白细胞和内皮细胞跨膜的蛋白质，ICAM1在稳定细胞间相互作用和促进白细胞和内皮细胞的迁移起到重要作用。ICAM-1的受体有淋巴细胞功能相关抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）和Mac-1，均属于整合素家族。LFA-1是ICAM-1的主要受体，而Mac-1与ICAM-1的亲和力较低，纤维蛋白原也可成为ICAM-1的配体之一。ICAM-1（G1548A）基因多态性研究表明ICAM-1表达增加为急性卒中的一个独立的危险因素[32]。

3 CE型卒中的相关血浆标志物

心源性脑栓塞占脑栓塞发病的60%～75%，是由于心内膜或心瓣膜产生的栓子脱落到达脑血管，造成动脉堵塞致病。其中，心房颤动为心源性栓塞最常见的原因，心房颤动时左房收缩性降低，血流缓慢淤滞，易导致附壁血栓，栓子脱落形成脑栓塞。

3.1 可溶性晚期糖基化终产物受体 晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）属于细胞表面分子免疫球蛋白超家族中的一个成员，可与多种配体结合后影响细胞内信号转导、刺激细胞因子释放等从而发挥其生物学效应，与动脉粥样硬化及炎症等密切相关。胞外区的RAGE称可溶性晚期糖基化终产物受体（soluble receptor for advanced glycation endproducts，sRAGE），可阻断配体与RAGE结合，抑制RAGE的作用。

Montaner等[33]的研究显示，与动脉粥样硬化血栓形成及腔隙性梗死相比，心源性脑栓塞患者的sRAGE水平较高，提示sRAGE水平可为脑梗死亚型的判断提供诊断依据。Park等[34]的研究显示，非心源性卒中患者sRAGE水平较低，认为低sRAGE水平是动脉粥样硬化过程的潜在生物学标志物。

本课题组采用酶联免疫吸附测定法检测CE患者37例，LAA患者36例，以及无症状大动脉狭窄患者43例，健康对照组48例血浆中sRAGE的浓度，并比较各组sRAGE水平的差异，研究结果表明sRAGE浓度增高是CE的独立危险因素；log sRAGE=3.5197 pg/ml可作为鉴别CE与LAA的最佳临界值；且sRAGE水平增高可考虑用于判断CE的复发（待发表）。

3.2 D二聚体与脑钠肽 已有研究对707例缺血性卒中患者进行血液生物标志物检测，结果显示脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）及D二聚体（D-Dimer）等在心源性栓塞卒中亚型患者中高表达且对CE预测如下：当BNP＞76 pg/ml及D-dimer＞0.96 μg/ml时，OR值（odds ratios）分别为2.3与2.2[35]。

综上所述，血浆标志物可以帮助临床医生对缺血性脑血管病进行准确的病因分型，为进一步指导治疗及二级预防提供了新的依据。要找到缺血性卒中不同亚型的血浆标志物，需具备特异性强、敏感度高且利于TOAST亚型区分等特点。但目前上述标志物仍需进一步研究与验证。

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