巯基功能化磁性微球的构建及其对蛋白质的亲和分离

巯基功能化磁性微球的构建及其对蛋白质的亲和分离

刘珊珊1，邹雪艳2*，郭静玉1，刘锦1，陈丹云1

(1. 河南大学 化学化工学院,河南 开封 475004；2.河南大学 特种功能材料重点实验室, 河南 开封 475004)

摘要：通过水热法一步合成了纳米Fe3O4微球，并在甲苯中用巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)对其进行表面修饰得到了Fe3O4-SH微球，通过DTNB法测得微球表面巯基含量为333.54 μg/mg. 该纳米微球可以吸附溶液中的Ni2+，从而形成Fe3O4-SH-Ni2+复合材料. 以此复合材料为载体，可以将以组氨酸为标签的(His-tagged)融合蛋白直接从细胞裂解液中进行提纯，并在外加磁场的作用下实现对目标蛋白的快速分离，其对His-tagged TRX蛋白的分离能力为20.6 μg/mg，特别适合于对以组氨酸为标签蛋白的分离纯化.

关键词：四氧化三铁；巯基；组氨酸；蛋白质分离；亲和

中图分类号：O61 文献标志码：A

收稿日期：2015-1-24.

基金项目：国家自然科学基金(21271062)，河南省教育厅科学技术重点研究项目(14B150003)．

作者简介：刘珊珊(1991-), 女, 硕士生, 研究方向为复合纳米材料的制备. *通讯联系人, E-mail:zouxueyan@henu.edu.cn.

Construction of thiol-functional magnetic microspheres and

affinity separation of protein

LIU Shanshan1, ZOU Xueyan2*, GUO Jingyu1, LIU Jin1, CHEN Danyun1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China;

2.KeyLaboratoryforSpecialFunctionalMaterials,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Abstract:Ferriferrous oxide magnetic microspheres (MSs) were prepared via solvothermal route. The so-obtained MSs were modified by (3-mercapto-propyl)trimethoxysilane (MPS) in mythylbenzene to give birth of the ferriferrous oxide with thiol group (Fe3O4-SH) microspheres, which can absorb Ni2+ to form Fe3O4-SH-Ni2+. The amount of thiol group of Fe3O4-SH was tested to be 333.54 μg/mg by means of DTNB method. After chelating Ni2+ ions, Fe3SH-Ni2+ MSs were used to enrich and purify histidine-tagged (His-tagged) proteins directly from the mixture of lysed cells without pretreatment. Moreover, the prepared MSs can separate the target protein quickly in the magnetic field. It has been found that Fe3O4-SH-Ni2+ MSs present negligible nonspecific protein adsorption and high protein binding activity with the saturation capacity being 20.6 μg/mg and they are especially suitable for rapid purification of His-tagged proteins.

Keywords:Fe3O4; thiol group; His-tagged; protein separation; affinity

蛋白质的分离纯化，特别是微量蛋白的纯化，在蛋白组学领域是一个重要课题[1-4]. 传统的蛋白质的分离纯化通常对目标蛋白都具有较高的选择性[5-6]，然而这些方法都需要采用多步处理，如沉淀、透析、超过滤和层析等，处理工艺比较复杂、费时且成本较高. 随着生物学的发展，蛋白质可以带上某一标签进行表达，从而使蛋白质可以通过此标签被特异性的分离纯化[7-8]. 在这些亲和标签中，以六聚组氨酸为标签的(His-tagged)蛋白使用最为广泛. 这些His-tagged蛋白很容易通过微生物细胞进行表达，从而使这些标签蛋白在其体内大量产生[9-10]. 在这些His-tagged的蛋白中，六聚组氨酸链对某些金属离子具有亲和力，如Ni2+和Cu2+，它们能特异性的固定这些金属离子，并且这些金属离子都可以再生[11-12]. 近年来，纳米颗粒和纳米棒作为一种新兴的载体被用于蛋白质的分离[13-16]. 尽管如此，这些合成方法仍有一定的局限性，如载体材料分离蛋白后难以从混合蛋白中分离，很难实现蛋白质的快速分离. 为了便于实现材料的高效快速分离，本文作者以磁性纳米Fe3O4为载体[17]，在其表面修饰巯基，从而在外加磁场的作用下，显著地提高了材料分离蛋白的效率，以便于蛋白的分离提纯.

1实验部分

1.1　试剂与仪器

巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS，95%)购自Alfa-Aesar公司；甲苯、三氯化铁(FeCl3·6H2O)、氯化镍(NiCl2·6H2O)均购自天津市科密欧化学试剂有限公司.

样品的形貌及组成用透射电子显微镜(TEM，JEOL JEM-2010型，日本电子株式会社)、傅立叶变换红外光谱仪(IR，AVATAR360型，美国尼高力公司)以及X射线衍射仪(XRD，X-PertPro，荷兰飞利浦)进行表征. 用紫外可见分光光度计(UV-Vis，752N型，上海奥普勒仪器有限公司)进行表面巯基含量的测定. 磁滞回线由VSM振动样品磁强计(VS M, Lake Sh ore 7410，中国计量科学研究院)进行测定. 捕获的His-tagged蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGEw，Poer PAC 300，郑州宝赛科贸有限公司)，稳压电压是70 V，分离电压是120 V.

1.2　实验过程

1.2.1磁性Fe3O4微球的制备

在50 mL锥形瓶中加入0.135～2.16 g FeCl3、2.7 g无水乙酸钠和30 mL 乙二醇，室温下搅拌1 h后转入高温反应釜中，于160 ℃反应12 h，自然冷至室温. 磁性离心分离，沉淀分别用无水乙醇和去离子水洗涤数次，于60 ℃真空烘干24 h，即得到Fe3O4样品.

1.2.2Fe3O4-SH的制备

取0.1 g上述Fe3O4样品于100 mL三口瓶中，加入30 mL甲苯, 分散均匀；加入0.2 mL MPS，在室温下继续搅拌30 min，然后升温至93 ℃反应12 h. 产物分别用异丙醇和去离子水洗涤数次，于60 ℃真空烘干24 h，即得到Fe3O4-SH样品. 得到的样品采用DTNB法检测表面巯基的含量[18].

1.2.3Fe3O4-SH微球吸附Ni2+

准确称取5 mg Fe3O4-SH样品分散在50 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液中，于25 ℃水浴震荡反应2 h. 沉淀用水反复洗涤6次，然后分散在1 mL 25%的乙醇中备用.

1.2.4Fe3O4-Ni2+微球对His-tagged蛋白的分离

文中分离的蛋白为His-tagged Thioredoxin(His-tagged TRX)，来自于PET-32a质体[19]. 六聚组氨酸为标签的重组质体被植入大肠杆菌体内，并用常规的方法进行蛋白的表达[20]. 一般来说，所有His-tagged融合蛋白都可以用亲和分离的方法捕获和富集. 蛋白分离的具体步骤如下：首先用1 000 μL破菌buffer(20 mmol/L pH=7.6 Tris-HCl，含0.2 mol/L NaCl)洗涤Fe3O4-SH-Ni2+复合材料，然后将这些复合材料加入到1 500 μL 细胞裂解液中，在摇床上(90 r/min)室温孵化2 h；随后，将捕获了的Fe3O4-Ni2+复合材料进行离心，并用破菌buffer洗涤3次以去除表面残留的蛋白；最后，将捕获的His-tagged TRX蛋白用300 μL咪唑(1 mol/L)洗脱，取洗涤后的上清液进行SDS-PAGE分析，剩余的上清液用于目标蛋白的定量检测.

2结果与讨论

2.1　反应条件的影响

图1为加入不同量的铁源制备的Fe3O4样品的TEM和XRD图，图1a~e加入的FeCl3的量分别为0.135 g(0.5 mmol)、0.27 g(1 mmol)、0.54 g(2 mmol)、1.35 g(5 mmol)和2.16 g(8 mmol). 从图中可以看出，当铁源的质量小于0.54 g时，制备的样品为球形，但表面由许多小颗粒组成，平均粒径为200 nm；而当铁源质量大于1.35 g时，制备的样品为实心球，平均粒径为600 nm. 图1f中曲线b-e分别为FeCl3的加入量为1、2、5、8 mmol时Fe3O4样品的XRD图. 从图1中还可以看出，制备的4种Fe3O4样品主体结构一致，在(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)处的衍射峰均对应于立方结构的Fe3O4，说明所制备的Fe3O4纳米微球为面心立方结构，与PDF卡(75-0033)的特征峰一致.

2.2　巯基含量的定量检测

我们选择铁源初始加入量为2 mmol(图1c)和5 mmol(图1d)条件下制备的Fe3O4样品进行表面修饰，得到了两种Fe3O4-SH样品，分别记作样品Fe3O4-SH(2 mmol)和Fe3O4-SH(5 mmol). 通过DTNB法定量检测表面巯基含量，样品Fe3O4-SH(2 mmol)和Fe3O4-SH(5 mmol)表面的巯基含量分别为333.5和163.3 μg/mg. 这可能是由于当铁源初始量为2 mmol时制备的样品表面由许多小颗粒组成，增加了比表面积，在进行表面修饰时可以更多的与-SH结合，而当铁源初始量为5 mmol时制备的Fe3O4样品为实心球，比表面积小，所以表面巯基含量更低.

FeCl 3的加入量：(a) 0.5 mmol; (b) 1 mmol; (c) 2 mmol; (d) 5 mmol; (e) 8 mmol. 图1　不同FeCl 3加入量下制备的Fe 3O 4样品的TEM图和XRD图 Fig.1　TEM images and XRD spectrum of Fe 3O 4 samples obtained under different FeCl 3 dos

2.3　Fe 3O 4-SH微球的表征

2.3.1TEM和磁滞回线分析

选用表面巯基含量较高的样品Fe3O4-SH(2 mmol)为载体用于目标蛋白的分离. 图2为铁源加入量为2 mmol条件下制备的Fe3O4-SH样品的TEM(图2a)、在外加磁场作用下磁性分离的效果图(图2b)以及对应的磁滞回线图(图2c). 从图中可以看出，表面修饰巯基前后的样品形貌基本与图1c保持一致，Fe3O4-SH样品形貌仍为球形，表面由很多小颗粒组成，平均粒径约为200 nm. 从图2b可以看出，制备的样品在外加磁场的作用下能够快速的从溶液中分离出来. 图2c为样品在300 K条件下测得的磁滞回线. 从图中可以看出，制得的样品具有很好的磁性，其饱和磁化强度为130.9 emu·g-1，矫顽力为55.2 Gs.

2.3.2XRD分析

图3为制备的Fe3O4和Fe3O4-SH样品的XRD图，从图中可以看出，Fe3O4-SH样品与修饰前的XRD主峰基本保持一致，在(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)处都有特征峰，仍为面心立方结构，与PDF卡(75-0033)的特征峰一致.

2.3.3IR分析

图4为制备的Fe3O4和Fe3O4-SH样品的IR图. 从图中可以看出，584和3 460 cm-1分别对应Fe3O4的特征吸收峰和其表面的羟基伸缩振动峰；1 634 cm-1为表面结合水的H-O-H 的弯曲振动峰；可以看出，Fe3O4-SH的主体峰位与Fe3O4基本一致，但在2 925和2 852 cm-1出现了亚甲基的伸缩振动峰，说明微球的表面修饰了-SH.

图2　Fe 3O 4-SH样品的TEM(a)，在外加磁场作用下的照片(b)及磁滞回线(c) Fig.2　TEM image of Fe 3O 4-SH sample (a), Fe 3O 4-SH sample show a strong magnetic response to an applied magnetic field (b) room temperature (300 K) magnetic hysteresis loops of Fe 3O 4-SH sample (c).

2.3.4蛋白分离示意图

图5为样品的制备及分离蛋白的示意图. 文中采用FeCl3为铁源，通过水热法一步制得Fe3O4微球，然后在甲苯体系中表面修饰了巯基，进一步吸附Ni2+后，可用于分离His-tagged的融合蛋白. 在外加磁场的作用下，可实现对目标蛋白的快速分离.

图3　制备Fe 3O 4和Fe 3O 4-SH样品的XRD图 Fig.3　XRD pattern of Fe 3O 4 and Fe 3O 4-SH samples

图4　样品Fe 3O 4和Fe 3O 4-SH的IR谱图 Fig.4　IR spectra of Fe 3O 4 and Fe 3O 4-SH samples

图5　制备样品分离蛋白质示意图 Fig.5　Procedure of the preparation of Fe 3O 4-SH-Ni 2+ microspheres and the enrichment and separation of His-tagged proteins

2.3.5SDS-PAGE分析

图6为用制备的样品分离His-tagged TRX蛋白的电泳图，泳道1为Marker，泳道2为混合蛋白，泳道3为用制备微球分离混合蛋白的条带，其中His-tagged TRX蛋白的相对分子质量为22 kD. 从图6中看出，制备的磁性纳米微球能够从混合蛋白中分离出His-tagged TRX蛋白，而且对His-tagged TRX蛋白纯化的特异性很高. 通过对目标蛋白的定量检测可知，制备微球对His-tagged TRX蛋白的分离能力为20.6 μg/mg.

泳道：(1) Marker；(2) 大肠杆菌细胞裂解液； (3) 制备微球对混合蛋白的分离. 图6　微球分离His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE图 Fig.6　SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

3结论

通过水热法合成了纳米Fe3O4，再通过表面修饰得到了Fe3O4-SH微球. 该纳米微球可以吸附溶液中的Ni2+，从而直接用于分离以组氨酸为标签的(His-tagged)融合蛋白，并且在外加磁场的作用下可实现对目标蛋白的快速分离. 实验证明，所制备的材料对蛋白的分离效果很好，且能够实现对目标蛋白的特异性分离，在实现对组氨酸为标签蛋白的快速分离方面具有一定的应用价值.

参考文献：

[1] SETO H, OGATA Y, MURAKAMI T, et al. Selective protein separation using siliceous materials with a trimethoxysilane-containing glycopolymer [J]. ACS Appl Mater Inter, 2012, 41: 411-417.

[2] LAO U L, MULCHANDANI A, CHEN W. Simple conjugation and purification of quantum dot-antibody complexes using a thermally responsive elastin-protein L scaffold as immunofluorescent agents [J]. J Am Chem Soc, 2006, 128(46): 14756-14757.

[3] LIU C M, MONSON C F, YANG T L, et al. Protein separation by electrophoretic- electroosmotic focusing on supported lipid bilayers [J]. Anal Chem, 2011, 83: 7876-7880.

[5] XIE H Y, ZHEN R, WANG B, et al. Fe3O4/Au core/shell nanoparticles modified with Ni2+- nitrilotriacetic acid specific to histidine-tagged proteins [J]. J Phys Chem C, 2010, 114: 4825-4830.

[6] YANG L R, GUO C, CHEN S, et al. pH-sensitive magnetic ion exchanger for protein separation [J]. Ind Eng Chem Res, 2009, 48: 944-950.

[7] LEE I S, LEE N, PARK J, et al. Ni/NiO core/shell nanoparticles for selective binding and magnetic separation of histidine-tagged proteins [J]. J Am Chem Soc, 2006, 128: 10658-10659.

[8] LEE K S, LEE I S. Decoration of superparamagnetic iron oxide nanoparticles with Ni2+: agent to bind and separate histidine-tagged proteins [J]. Chem Commun, 2008,14(6): 709-711.

[9] PORATH J, CARLSSON J, OLSSON I, et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation [J]. Nature, 1975, 258: 598-599.

[10] XU F, GEIGER J H, BAKER G L, et al. Polymer brush-modified magnetic nanoparticles for his-tagged protein purification [J]. Langmuir, 2011, 27: 3106-3112.

[11] AHRENDS R, PIEPER S, NEUMANN B, et al. Metal-coded affinity tag labeling: a demonstration of analytical robustness and suitability for biological applications [J]. Anal Chem, 2009, 81: 2176-2184.

[12] KIM J, PIAO Y, LEE N, et al. Magnetic nanocomposite spheres decorated with NiO nanoparticles for a magnetically recyclable protein separation system [J]. Adv Mater, 2009, 22: 57-60.

[13] GOTO Y, MATSUNO R, KONNO T, et al. Polymer nanoparticles covered with phosphorylcholine groups and immobilized with antibody for high-affinity separation of proteins [J]. Biomacromolecules, 2008, 9: 828-833.

[14] XU C J, XU K M, GU H W, et al. Nitrilotriacetic acid-modified magnetic nanoparticles as a general agent to bind histidine-tagged proteins [J]. J Am Chem Soc, 2004, 126: 3392-3393.

[15] MIZRAHI B, IRUSTA S, MCKENNA M, et al. Microgels for efficient protein purification [J]. Adv Mater, 2011, 23: H258-H262.

[16] OH B K, PARK S, MILLSTONE J E, et al. Separation of tricomponent protein mixtures with triblock nanorods [J]. J Am Chem Soc, 2006, 128: 11825-11829.

[17] 王现红, 贺攀科, 程文正, 等. 单分散性双相可溶四氧化三铁纳米微粒的多醇法制备及磁性[J]. 化学研究, 2014, 25(2): 119-123.

[18] LI B J, ZOU X Y, ZHAO Y B, et al. Biofunctionalization of silica microspheres for protein separation [J]. Mat Sci Eng C, 2013, 33: 2595-2600.

[19] LAVALLIE E R, REHEMTULLA A, RACIE L A, et al. Cloning and functional expression of a cDNA encoding the catalytic subunit of bovine enterokinase [J]. J Biol Chem, 1993, 268: 23311- 23317.

[20] SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular cloning: a laboratory manual [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: 33-34.

[责任编辑：毛立群]