甲基硝基亚硝基胍对哈萨克族正常食管上皮细胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表达的影响

甲基硝基亚硝基胍对哈萨克族正常食管上皮细胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表达的影响

陈艳1， 邓彦超2,3， 黄思语1

(1新疆医科大学公共卫生学院，2新疆医科大学第一附属医院胸外科，3新疆食管癌研究所， 乌鲁木齐830011)

摘要:目的探讨N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)对哈萨克族(哈族)正常食管上皮细胞LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化及其表达的影响。方法将体外培养的哈族正常食管上皮细胞暴露于含0、0.75、1.5、3 μg/mL MNNG的培养基中24 h，分别为对照组、0.75 μg/mL组、1.50 μg/mL组、3.00 μg/mL组。用甲基化特异性聚合酶链(MSP)法检测LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化状态，用RT-PCR和Western Blot法检测LRRFIP1、ALDH1L1基因mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较，各浓度组细胞LRRFIP1基因甲基化状态没有改变；各组细胞LRRFIP1基因mRNA表达水平分别为(1.021±0.237)、(2.828±0.350)、(1.453±0.179)、(1.952±0.223);与对照组比较,0.75 μg/mL组和3.00 μg/mL组表达均升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，1.50 μg/mL和3.00 μg/mL组LRRFIP1蛋白表达水平均升高，分别为(4.233±0.048)、(4.519±0.033)、(5.377±0.057)，差异有统计学意义(P<0.05)；高浓度组细胞ALDH1L1基因有从部分甲基化向完全甲基化转变的趋势，各组ALDH1L1基因mRNA表达水平分别为(1.023±0.254)、(5.046±0.603)、(2.259±0.030)、(7.616±1.910)，与对照组比较各浓度组均升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；各组细胞ALDH1L1蛋白表达水平分别为(0.725±0.014)、(0.913±0.033)、(1.142±0.010)、(1.334±0.047)，与对照组比较各浓度组均升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论MNNG可促进哈族正常食管上皮细胞ALDH1L1基因甲基化及LRRFIP1、ALDH1L1表达的升高。

关键词：哈萨克族； 食管上皮细胞； LRRFIP1； ALDH1L1

中图分类号：R735.1文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.008

[收稿日期：2014-09-22]

Effects of MNNG on methylation and expression of LRRFIP1, ALDH1L1

on Kazakh normal esophageal epithelial cells

CHEN Yan1, DENG Yanchao2,3, HUANG Siyu1

(1PublicHealthCollege,XinjiangMedicalUniversity,2DepartmentofChestSurgery,

TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,3XinjiangInstituteforEsophageal

CancerResearch,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of MNNG on methylation and expressions of LRRFIP1 and ALDH1L1 on Kazakh normal esophageal epithelial cells. MethodsMethylation of LRRFIP1 and ALDH1L1 were detected by MSP, the mRNA and protein level of LRRFIP1 and ALDH1L1 were detected by RT-PCR and Western Blot. ResultsCompared with the control group, each group of cells with LRRFIP1 gene methylation status did not change, the expressions of LRRFIP1 mRNA level in each groups were (1.021±0.237), (2.828 ±0.350), (1.453±0.179), (1.952±0.223), the LRRFIP1 mRNA level in low concentration group and high concentration group of cells were significantly higher than the control group (P<0.05), the expressions of LRRFIP1 protein level in control group and high concentration group were (4.233±0.048), (5.377±0.057), the LRRFIP1 protein level in high concentration group of cells were significantly higher than the control group (P<0.05), high concentration group of cells with ALDH1L1 gene was trended from partial methylation to completely methylation, the expressions of ALDH1L1 mRNA level in each groups were (1.023±0.254), (5.046±0.603), (2.259 ±0.030), (7.616±1.910), the ALDH1L1 mRNA level in each group was significantly higher than the control group (P<0.05), the expressions of ALDH1L1 protein level in each groups were (0.725±0.014), (0.913±0.033), (1.142±0.010), (1.334±0.047), the ALDH1L1 protein level in each concentration groups were significantly increased (P<0.05). ConclusionAt some concentration point, MNNG significantly affects the methylation of ALDH1L1 and the expressions of p16 and FHIT on Kazakh normal esophageal epithelial cells.

Key words: Kazakh; esophageal epithelial cells;LRRFIP1;ALDH1L1

亚硝胺类化合物属亚硝基化合物，包括亚硝胺与亚硝酞胺两类。目前为止已发现的亚硝胺有300多种，其中90%以上的亚硝胺化合物对动物有致畸、致突变及致癌作用[1]。N-亚硝胺类烷化剂能诱导多种疾病的发生。研究结果表明，N-亚硝胺类化合物是诱发人类癌症的原因之一[2-3]。N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是一种人工合成的亚硝胺类化合物，常被用于研究亚硝胺类化合物诱发肿瘤的工具。动物实验证明，MNNG可以导致多种肿瘤的发生[4-5]。富含亮氨酸重复序列相互作用蛋白1[(leucinerich repeat(in FLII) interacting protein 1，LRRFIP1)]基因位于人类17号染色体上，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的信号组成成分[6]。醛脱氢酶1家族L1基因(aldehyde dehydrogenase 1 family member L1，ALDH1L1)位于人类3号染色体的长臂上(3q21.2)，参与细胞增殖的调节，是存在于细胞质中的一个与叶酸代谢有关的酶基因[7]。本课题组的前期研究结果表明，在哈萨克族(哈族)食管癌患者癌组织中LRRFIP1和ALDH1L1基因发生了甲基化[8-9]。本研究使用MNNG对体外培养的哈族食管正常上皮细胞染毒，从而模拟N-亚硝胺类化合物暴露后，正常食管上皮细胞LRRFIP1和ALDH1L1基因甲基化状态及其表达的变化，初步探讨N-亚硝胺类化合物致食管上皮组织发生病变的机制。

1材料与方法

1.1细胞与主要试剂哈族食管正常上皮细胞株(课题组自行培养的原代细胞)，MNNG(TCI公司)，甲基化修饰试剂盒(Chemicon公司)，Trizon提取试剂盒(Invitrogen公司)，cDNA第一链合成试剂盒(Ambion公司)，引物(上海生工生物工程技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养哈族食管正常上皮细胞常规培养于EpicM-2无血清培养基中(内含青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)，37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长汇合至90%时按照1∶3传代培养。待细胞生长至对数期时培养瓶加入含不同浓度(0、0.75、1.50、3.00 μg/mL)MNNG的培养基5 mL，分别为对照组、0.75 μg/mL组、1.50 μg/mL组和3.00 μg/mL组。

1.2.2MSP法检测LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化状态

1.2.2.1总DNA的提取细胞染毒24 h后，采用血液基因组DNA快速抽提试剂盒提取总DNA。

1.2.2.2甲基化特异性PCR(1)引物合成：由上海生工生物工程公司设计、合成，引物序列见表1。(2)亚硫酸氢钠修饰：采用甲基化修饰试剂盒对提取的DNA进行修饰。(3)扩增体系：包括dNTPs 0.5 μL、Forward primer 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、DNA模板2.0 μL、Taq Buffer 2.5 μL、MgCl22.0 μL、Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，加水补至25 μL。PCR反应条件：95℃预变性4 min，94℃变性25 s(甲基化63℃、非甲基化60℃)，72℃延伸30 s，共25个循环，最后72℃ 5 min。将扩增好的DNA行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统BioSens Gel Imaging System软件照相处理。

1.2.3RT-PCR法检测LRRFIP1、ALDH1L1 mRNA表达

1.2.3.1总RNA提取及cDNA合成采用Trizol提取试剂盒提取细胞内总RNA，第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。

表1　启动子区特异性引物序列

1.2.3.2聚合酶链式反应PCR(1)引物合成：由上海生工生物工程公司设计、合成，以管家基因GAPDH为内参，引物序列见表2。(2)扩增体系：包括SybrGreen qPCR Master Mix(2×) 10.0 μL 、上游与下游引物各1.0 μL 、cDNA 1.0 μL 、ddH2O 7.0 μL，总体积20 μL。PCR反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性10 s，LRRFIP1、ALDH1L1基因58℃和GAPDH基因57℃ 40 s，60℃延伸40 s，共40个循环，最后72℃ 5 min。将扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，采用2-△△CT法分析目的基因在对照组和各浓度组的表达差异。

表2　逆转录PCR引物序列

1.2.4Western blot 法检测LRRFIP1、ALDH1L1蛋白表达细胞经不同浓度MNNG染毒24 h后，加入细胞裂解液，充分混匀，离心，将提取的蛋白变性，10% SDS-PAGE电泳，湿转法低压转膜2.5 h。TBST漂洗后用5%的脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，TBST漂洗后将PVDF膜放入稀释的一抗(LRRFIP1抗体1∶200、ALDH1L1抗体1∶200、GAPDH抗体1∶1 000)中4℃过夜孵育。TBST漂洗，PVDF膜放入稀释的辣根酶标记的二抗溶液中，37℃孵育l h。在暗室中避光显色，并照X线片。用凝胶图像扫描分析系统对所得目的蛋白与内参蛋白的X线片分析，用灰度分析软件对每个条带的灰度值进行测定，获得每条目的蛋白及内参蛋白的灰度值，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

2结果

2.1LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化状态

2.1.1LRRFIP1基因甲基化检测结果 哈族食管上皮细胞经MNNG作用24 h后，对照组与0.75、1.50、3.00 μg/mL组的PCR反应产物电泳结果见图1。各组均可见LRRFIP1基因无甲基化的特异性基因片段(186 bp)表达，未见LRRFIP1基因甲基化特异性基因片段(185 bp)表达，说明哈族食管正常上皮细胞经不同浓度MNNG染毒24 h后LRRFIP1基因甲基化状态保持无甲基化状态不变。

M：LRRFIP1-M特异性引物扩增条带185 bp；U：LRRFIP1-U特异性引物扩增条带186 bp，1、2、3、4分别为对照组和0.75、1.50 、3.00 μg/mL组，5为甲基化基因标准品

图1MSP法检测哈族食管上皮细胞经MNNG染毒后LRRFIP1基因甲基化状态

2.1.2ALDH1L1基因甲基化检测结果 哈族食管上皮细胞经MNNG作用24 h后，对照组和0.75、1.50、3.00 μg/mL组的PCR反应产物电泳结果见图2。各组均可见ALDH1L1基因无甲基化特异性基因片段(127 bp)及ALDH1L1基因甲基化特异性基因片段(115 bp)的表达。3.00 μg/mL组无甲基化特异性片段亮度明显较对照组和0.75、1.50 μg/mL组弱，而甲基化特异性片段亮度较对照组和0.75、1.50 μg/mL组强，说明3.00 μg/mL组ALDH1L1基因启动子区有部分胞嘧啶发生了甲基化。

2.2LRRFIP1、ALDH1L1基因mRNA及蛋白表达

2.2.1LRRFIP1基因mRNA表达 MNNG染毒24 h后，各组细胞间LRRFIP1基因表达水平不同，差异有统计学意义(F=27.680，P<0.05)。0.75 μg/mL组LRRFIP1基因表达水平上调，是对照组的2.828倍，差异有统计学意义(t=7.398，P<0.01)；与对照组比较，1.50 μg/mL组LRRFIP1基因表达水平差异无统计学意义(t=2.515，P>0.05)；与对照组比较，3.00 μg/mL组LRRFIP1基因表达水平是对照组的1.952倍，差异有统计学意义(t=4.940，P<0.01)，见表3。

M： ALDH1L1-M特异性引物扩增条带115 bp；U：ALDH1L1-U特异性引物扩增条带127 bp，1、2、3、4分别为对照组和0.75、1.50 、3.00 μg/mL组，5为甲基化基因标准品

图2MSP法检测哈族食管上皮细胞经MNNG染毒后

ALDH1L1基因甲基化状态

2.2.2LRRFIP1蛋白表达哈族正常食管上皮细胞经MNNG染毒24 h后，各组细胞LRRFIP1蛋白表达水平不同，差异有统计学意义(F=139.271，P<0.01)，LRRFIP1蛋白表达水平随染毒剂量的增加而升高(r=0.888，P<0.01)。与对照组比较，0.75 μg/mL组LRRFIP1蛋白表达差异无统计学意义(t=3.488，P>0.05)；1.50 μg/mL和3.00 μg/mL组LRRFIP1蛋白表达水平均明显高于对照组，差异均具有统计学意义(t=6.894，P<0.05； t=20.599， P<0.01)，见表3、图3。

1：对照组； 2：0.75 μg/mL； 3：1.50 μg/mL； 4：3.00 μg/mL

图3　哈族食管上皮细胞经MNNG染毒后LRRFIP1蛋白表达

注: 与对照组比较，△P<0.05； 与0.75 μg/mL组比较，▲P<0.05； 与1.50 μg/mL组比较，#P<0.05。

2.2.3ALDH1L1基因mRNA表达 MNNG染毒24 h后，各组细胞间ALDH1L1基因表达水平不同，差异均有统计学意义(F=25.561，P<0.05)，ALDH1L1基因表达水平随染毒剂量的增加而升高(r=0.764，P<0.05)。与对照组比较，0.75 μg/mL组ALDH1L1基因表达水平是对照组的5.046倍，ALDH1L1基因表达水平上调，差异有统计学意义(t=10.648，P<0.01)；与对照组比较，1.50 μg/mL组ALDH1L1基因表达水平是对照组的2.259倍，ALDH1L1基因表达水平上调，差异有统计学意义(t=8.377，P<0.01)；3.00 μg/mL组ALDH1L1基因表达水平上调是对照组的7.616倍，差异有统计学意义(t=5.926，P<0.01)，见表4。

2.2.4ALDH1L1蛋白表达 哈族正常食管上皮细胞经MNNG染毒24 h后，各组细胞ALDH1L1蛋白表达水平不同，差异有统计学意义(F=156.617，P<0.01)，ALDH1L1蛋白表达水平随染毒剂量的增加而升高(r=0.976，P<0.01)。与对照组相比，0.75、1.50 、3.00 μg/mL组ALDH1L1蛋白表达水平均高于对照组，差异均具有统计学意义(t′=7.410，P<0.05；t=33.861，P<0.01；t′=17.493，P<0.01)，见表4、图4。

1：对照组； 2：0.75 μg/mL； 3：1.50 μg/mL； 4：3.00 μg/mL

图4哈族食管上皮细胞经MNNG染毒后ALDH1L1蛋白表达

3讨论

食管癌(esophageal cancer, EC)是发生于食管上皮组织的常见消化系统恶性肿瘤，主要流行于发展中国家，世界食管癌发病率存在显著的地域差异，高发区与低发区人群食管癌死亡率和发病率相差可达500倍[10]。不同种族食管癌发病率有很大差异，新疆是我国食管癌高发区之一，以哈萨克族人群死亡率最高[11]。

研究表明LRRFIP1基因在动物胚胎发育、表皮生长、平滑肌细胞的发育以及肿瘤和心血管病的发病中发挥重要作用[12]。新疆哈萨克族食管鳞癌DNA异常甲基化基因发现LRRFIP1基因在癌组织中发生甲基化[13]。在乳腺癌患者非癌组织中LRRFIP1蛋白表达弱阳性，而乳腺浸润性导管癌和浸润性小叶癌组织中超过50%的组织表达强阳性，并且LRRFIP1基因的表达强度与淋巴浸润程度有关[14]。

表4　哈族食管上皮细胞经MNNG染毒后ALDH1L1基因及蛋白表达(n=3, ±s)

注： 与对照组比较，△P<0.05； 与0.75 μg/mL组比较，▲P<0.05； 与1.50 μg/mL组比较，#P<0.05。

研究表明ALDH1L1基因有类似抑癌基因的特性，具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[15-16]。Natalia等[7]检测肺腺癌细胞系A549、肝癌细胞系HePG2和结肠癌细胞系HCT116的启动子CpG岛甲基化水平，结果表明这3种细胞系的ALDH1L1基因启动子均发生甲基化。本课题组的前期研究结果表明新疆哈萨克族食管鳞癌DNA异常基因甲基化中ALDH1L1基因发生甲基化，该基因参与甲酰四氢叶酸的分解代谢及一碳化合物的分解代谢[13]。ALDH1L1基因在多种肿瘤细胞系中低表达，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌细胞系等[17]。Natalia等[16]对肺腺癌组织及相对应癌旁组织和肝癌组织及相对应癌旁组织ALDH1L1基因mRNA和蛋白表达进行检测，研究结果表明，在肺腺癌组织及肝癌组织中ALDH1L1基因mRNA和蛋白表达水平均低于对应的癌旁组织。研究发现ALDH1L1基因在肝癌中的表达，在癌组织中ALDH1L1 mRNA及蛋白表达水平与正常组织相比显著下降，癌旁正常组织ALDH1L1 mRNA表达水平是癌组织的10倍，ALDH1L1基因表达下降影响是肝癌患者预后的危险因素[18]。

本研究采用不同浓度MNNG对哈族正常食管上皮细胞染毒24 h后检测各浓度组LRRFIP1、ALDH1L1基因的甲基化状态及其表达。研究结果表明，LRRFIP1基因一直处于无甲基化状态，而经高浓度MNNG处理后的哈族食管上皮细胞ALDH1L1基因甲基化特异性片段表达较对照组和0.75、1.5 μg/mL组高，非甲基化特异性片段表达较对照组和低、中浓度组低，说明高浓度MNNG使得哈族食管上皮细胞ALDH1L1基因有甲基化的趋势。与对照组比较，LRRFIP1和ALDH1L1基因mRNA及蛋白表达水平均与MNNG浓度呈正相关，随MNNG浓度的增高表达上调。说明基因甲基化的发生是基因表达下调的原因之一，在哈族食管癌的发生过程中，最先发生甲基化的是与叶酸代谢有关的基因ALDH1L1，这对今后预防哈族食管癌的发生具有重要意义。

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(本文编辑杨晨晨)