原代乳鼠心肌细胞分离培养的改进

原代乳鼠心肌细胞分离培养的改进

包馨慧, 李晓梅, 杨毅宁, 马依彤, 陈邦党, 陶静, 陈小翠

(新疆医科大学第一附属医院心脏中心, 乌鲁木齐830054)

摘要:目的探讨提高细胞纯度、存活率及活性的乳鼠心肌分离培养方法。方法改进心脏组织的处理方法，用胰酶预处理后再用II型胶原酶依次处理心肌组织，采用差速贴壁及化学药物纯化心肌细胞。结果提取的单个心肌细胞结构完整，呈类圆形；12 h时大部分细胞贴壁；24 h后几乎全部贴壁，仅见少量漂浮细胞，贴壁细胞伸出伪足，呈梭形、三角形等，细胞出现自主搏动。48 h后心肌细胞伪足间形成联接，交织成网状，局部心肌细胞出现同步搏动。3 d后心肌细胞聚集成簇，呈岛屿样搏动。心肌细胞存活率为96.6%，纯度>96%。结论此改进方法所提取培养的乳鼠心肌细胞存活率及纯度高，细胞活性好，结构功能完整，可用于相关实验中原代乳鼠心肌细胞的分离培养。

关键词:心肌细胞； 原代培养； 新生大鼠

中图分类号：Q463文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.010

[收稿日期：2014-07-02]

基金项目：国家药典委员会国家药品(维药)标准提高项目(510)

作者简介：刘杰(1980-)，男，硕士，主管中药师，研究方向：中药质量控制。

基金项目：国家自然科学基金(81260624)

作者简介：木克热木·吐地买提(1988-)，女(维吾尔族)，在读硕士，研究方向：食品毒理学。

An improved protocol for primary cultur of myocytes extracted from neonatal rat

BAO Xinhui, LI Xiaomei, YANG Yining, MA Yitong, CHEN Bangdang, TAO Jing, CHEN Xiaocui

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo improve the traditional method of culturing neonatal rat myocytes for the better purity, survival rate and activity of myocytes in experiments. MethodsTrypsin and type Ⅱ collagen enzyme were used to digest heart tissue and myocytes were purified with differential sticking wall method and chemical purification. ResultsThe extracted single myocyte is of structural integrity and circular shape. Most cells were touching to wall in 12 hours, and all cells sticking to wall in 24 hours, with small amount of floating cells. The touching-wall cells extended pseudopodia in the form of fusiformis, triangle and so on, with independent rhythm. Myocardial cells′ pseudopodia became connected into webs 48 hours later, with local synchronization rhythm. There days later, myocytes gethered into clusters, with island-like pulse. The activity and purity of myocytes was up to 96%. ConclusionThis method helped improve the activity and purity of myocytes, and protect the integrity of cells. The extracted myocytes could be used in relative experiments.

Key words: myocardial cell; primary culture; neonatal rat

乳鼠心肌细胞常被用作体外实验研究模型，用于心血管病的基础研究。虽然早在1960年，Harary等[1]已提出原代乳鼠心肌细胞分离培养方法，但由于这一传统方法所分离的心肌细胞存活率及纯度低、细胞活性差等原因，尚不能满足于基础研究的需求。目前所报道的培养方法大多基于传统方法进行改进[2-12]，主要分为单一酶消化法和混合酶消化法2种，前者单一使用胰酶消化会引起心肌细胞消化过度，降低心肌细胞的存活率；后者则由于消化能力减弱造成心肌组织消化不完全，获得心肌细胞数目较少。对于原代乳鼠心肌细胞分离培养仍无统一的方法。为了得到纯度及活力较高的心肌细胞而满足于实验的需要，本研究对乳鼠心肌细胞分离培养的方法进行了探索，改进了传统的分离方法，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物新生SD大鼠乳鼠(1~3 d)，由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.1.2实验试剂及设备胰蛋白酶(Sigma)，Ⅱ型胶原酶(Sigma)，D-Hanks(武汉博士德生物工程有限公司)，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青链霉素(Sigma)，5-溴脱氧尿核苷(Brdu，Sigma)，台盼蓝，抗cTNT抗体(Abcam)，二抗(Immuno Reagents)，驴血清，0.25% Triton-X100，4%多聚甲醛，PBS，DAPI(Immuno Reagents)，滤器，注射器，超净台(上海智城分析仪器制造有限公司)，二氧化碳培养箱(Thermo)，水浴锅，摇床，离心机，倒置荧光显微镜(Leica)。

1.2方法

1.2.1消化酶的配制胰酶和II型胶原酶均用D-Hanks配制，胰酶浓度为0.1%，Ⅱ型胶原酶浓度为0.08%，用NaHCO3或HEPES将pH调节为7.0~7.2。

1.2.2心肌细胞的培养及纯化取新生(1~3 d)SD乳鼠，75%乙醇消毒后开胸剪取心脏，将心脏放入预冷的D-Hanks中，用镊子轻轻挤压排出残留血液，剪取心尖1/3处，分别沿横轴、纵轴将心室剪为花瓣样，4~8瓣即可。将剪好的心肌组织放入提前配好并预冷的0.1%胰酶中，置于4℃冰箱水平摇床上，速度50次/min，过夜消化12~14 h。第2天用等体积的完全培养液中和胰酶，于37℃水浴摇床以90次/min速度震荡10 min后吸弃上清液。用配好的II型胶原酶消化心肌组织，37℃水浴摇床以90次/min速度震荡7~10 min，每次消化完的上清液吸入等体积的完全培养液中，将盛有含消化后上清液的离心管拧松瓶盖置于二氧化碳培养箱中，以此重复4~5次直至组织完全消化。所得的消化液1 200 r离心8 min。37℃水浴锅预热的完全培养液重悬得到细胞悬液，将其接种于直径为10 cm的培养皿中，置于二氧化碳培养箱中差速贴壁2次，时间分别为50、40 min。收集并计数差速贴壁后的细胞，用预热的完全培养液将细胞浓度调整为5×105/mL后加入Brdu 0.1 mmol/L。将细胞接种于6孔板中，用免疫荧光法检测心肌细胞纯度。静置培养48 h后换液，2~3 d更换1次培养液。

1.2.3心肌细胞存活率检测重悬时取细胞悬液稀释为约1×106个/mL，用0.4%台盼蓝染色，着色的为死细胞，其余为活细胞。显微镜下计数细胞以计算细胞存活率，细胞存活率=活细胞数/细胞总数。

1.2.4心肌细胞形态学观察倒置荧光显微镜下观察并记录心肌细胞在1、2、3 d及1 w时的形态、自主搏动情况及频率。

1.2.5心肌细胞纯度鉴定用免疫荧光法鉴定心肌细胞纯度，一抗为抗心肌肌钙蛋白T抗体，二抗标有红色荧光。将培养72 h的接有心肌细胞的6孔板用PBS清洗2~3遍，室温下4%多聚甲醛固定10 min，0.25% Triton-X100透化10 min，驴血清封闭30 min后加入一抗孵育1 h。加入二抗避光孵育1 h后用DAPI 1 μg/mL染色1 min。于倒置荧光显微镜下观察并计数心肌细胞。

2结果

2.1心肌细胞存活率台盼蓝染色计数356个细胞中12个染色阳性，344个染色阴性，细胞存活率为96.6%。

2.2心肌细胞形态学显微镜下可见刚分离出的单个心肌细胞结构完整,呈类圆形，12 h后大部分心肌细胞贴壁，出现少量的自主搏动，频率缓慢(5~10次/min)，24 h后几乎全部贴壁，仅见少量漂浮细胞，贴壁细胞伸出伪足，呈梭形、三角形等，贴壁细胞的细胞核大且胞浆丰富，立体感明显且折光性好，细胞出现自主搏动，搏动频率不同，为20~30次/min(图1)。48 h后心肌细胞伪足间形成联接,交织成网状，局部心肌细胞出现同步搏动(图2)。3 d后心肌细胞聚集成簇，呈岛屿样或放射状搏动(图3)。1 w后细胞搏动逐渐减弱，并出现细胞皱缩、脱落。

2.3心肌细胞纯度鉴定倒置荧光显微镜下鉴定心肌细胞(图4)，红色为与荧光标记二抗结合的特异性心肌肌钙蛋白cTNT，蓝色为DAPI所染细胞核。计数后心肌细胞纯度>96%。

3讨论

心肌细胞原代培养是心血管疾病基础研究中一个重要部分，如何分离培养出纯度高、活性好的心肌细胞对于实验研究至关重要。本研究对传统的原代乳鼠心肌细胞分离培养方法进行了改进，所提取培养的乳鼠心肌细胞存活率及纯度高，细胞活性好，结构完整，可用于相关实验中乳鼠心肌细胞培养，认为关键是平衡盐溶液的选择、溶液pH的调节、温度的调节、消化酶的选择及差速贴壁及化学药物抑制成纤维细胞。

ABC

图124 h后心肌细胞形态(A、B、C 分别为×100、×200、×400)

图248 h后心肌细胞形态(×100)>图372 h后心肌细胞形态(×100)A(×100) B(×400)

图4免疫荧光结果 ×400倍下可见心肌细胞肌丝结构

3.1平衡盐溶液的选择平衡盐溶液的选择非常重要，以往常用于配制试剂的平衡盐溶液主要有PBS、Hanks。然而，由于PBS、Hanks中含有Ca2+、Mg2+,能降低胰酶活性，因此在配置胰酶时要选择不含Ca2+、Mg2+的盐溶液以免胰酶活性降低而达不到消化的目的[13]。本研究参照文献[13]选择不含Ca2+、Mg2+的D-Hanks来配制胰酶。

3.2溶液pH的调节离体心肌细胞对pH非常敏感，培养液过酸或过碱均会影响心肌细胞的贴壁能力及活性[13]。本研究发现培养液pH在7.0~7.2时细胞贴壁最好，活性最佳。本实验在调节培养液及D-Hanks的pH值时添加了HEPES 10 mmol/L，因HEPES缓冲能力较强而无毒，有利于保持稳定的酸碱度。

3.3温度的调节在心肌细胞分离培养的整个过程中温度的控制非常重要。0.1%胰酶消化4℃过夜目的是降低胰酶的消化强度，使胰蛋白酶缓慢渗透到心肌组织内部，较温和地将细胞消化下来而又不伤害细胞膜和破坏细胞的结构[10-11]。以此方法预处理后所得的心肌细胞存活率及活性要高于37℃消化预处理。由于分离下来的心肌细胞对外界环境较敏感，本实验将完全培养液37℃水浴预热，使心肌细胞所处环境温度保持稳定，降低了外界温度变化对心肌细胞引起的伤害。

3.4消化酶的选择目前最常用于心肌细胞分离培养的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶[8-13]。胰蛋白酶主要用于分解组织间的蛋白成分，作用较强，使用时要把握好消化的浓度以及时间，消化过度会分解细胞膜表面蛋白破坏细胞膜，进而破坏细胞的结构和功能[14-15]。胶原酶能特异性地分解组织间的胶原纤维以释放心肌细胞，作用较温和，不会对心肌细胞造成伤害[2-5]。本研究选择低浓度0.1%胰酶4℃过夜预处理心肌组织，目的是使胰蛋白酶缓慢渗透到心肌组织内部，分解组织间质蛋白，使组织变疏松，之后再用Ⅱ型胶原酶多次消化。Ⅱ型胶原酶的浓度可根据使用乳鼠的心脏组织的个数来调整，少于10个心脏组织时Ⅱ型胶原酶浓度用0.08%，多于10个心脏组织可将浓度提高到0.1%。由于胶原酶消化能力较为缓和，可适当提高胶原酶浓度。

3.5差速贴壁及化学药物抑制成纤维细胞不同的细胞种类贴壁的时间不同，所分离的细胞中成纤维细胞较心肌细胞贴壁能力强，较早即可贴壁，因此可用差速贴壁法来分离心肌细胞与成纤维细胞。传统的方法差速贴壁1次，贴壁90 min，但由于细胞平铺于皿底，很多漂浮在培养液上层的成纤维细胞接触不到皿底，不能使成纤维细胞与皿底充分接触。本实验采用2次差速贴壁方法，加大了成纤维细胞与皿底接触的机会，有利于提高心肌细胞的纯度。Brdu的作用机理是代替胸腺嘧啶核苷参与DNA的合成，从而抑制生长细胞的增殖。研究表明，Brdu不会对心肌细胞造成影响[16]。本实验在培养液中加入Brdu,可在细胞长期培养中抑制成纤维细胞的增殖，保证心肌细胞的纯度。

本研究通过胰酶4℃过夜缓慢消化以及胶原酶温和特异性消化，并且控制液体的pH值和温度来提高细胞的存活率，用不含谷氨酰胺的完全培养液，2次差速贴壁以及化学药物来抑制成纤维细胞生长提高心肌细胞纯度。通过以上这些改进可得到纯度高、活性好且存活率高、结构功能完整的心肌细胞，为后续的实验研究创造了条件。

参考文献：

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(本文编辑杨晨晨)

通信作者：田树革， 男，博士， 教授， 博士生导师， 研究方向： 中药质量控制及评价， E-mail: tsgyz@sina.com。

通信作者：刘涛(1974-)，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：食品毒理学，E-mail：xjmult@163.com。