稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系的建立

·论著·

稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系的建立

吴敏李洁刘晓李钦芳郭晓榕湛先保

【摘要】目的建立稳定表达增强型GFP(EGFP)-LC3的AR42J细胞。方法利用慢病毒过表达载体Lentiviral-EGFP-LC3包装成慢病毒，感染大鼠胰腺腺泡细胞AR42J。以Lentiviral-EGFP感染作为阴性对照。通过倒置荧光显微镜观察及流式细胞分析仪检测病毒感染效率，蛋白质印迹法检测稳定传代细胞株的LC3蛋白表达。用毒胡萝卜素处理细胞建立内质网应激模型，采用蛋白质印迹法检测应激的AR42J细胞的LC3、PERK蛋白表达。结果AR42J细胞的Lentiviral-EGFP-LC3感染效率>85%，并能稳定传代。Lentiviral-EGFP-LC3感染的AR42J细胞的LC3 mRNA表达量为未感染细胞的(9.14±0.32)倍；LC3蛋白阳性表达并有EGFP-LC3融合蛋白的表达。Lentiviral-EGFP感染的AR42J细胞的LC3 mRNA表达量为未感染细胞的(1.08±0.07)倍，无LC3蛋白表达，仅有GFP表达。与未感染组比较，EGFP-LC3组的LC3 mRNA表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而EGFP组的差异无统计学意义。结论成功构建了稳定表达EGFP-LC3的大鼠胰腺外分泌细胞AR42J，为进一步研究急性胰腺炎与自噬的关系提供了新的细胞模型。

【关键词】慢病毒感染；自噬；细胞系；AR42J细胞

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.011

基金项目：国家自然科学基金(81170434，81370571)

收稿日期：(2015-01-03)

Establishment of a stable AR42J cell line expressing EGFP LC3WuMin,LiJie,LiuXiao,LiQinfang,GuoXiaorong,ZhanXianbao.DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:ZhanXianbao,Email:zhanxianbao@126.com

Abstract【】ObjectiveTo establish a stable AR42J cell line expressing EGFP LC3. MethodsThe EGFP LC3 overexpressed Lentivirus was constructed and transfected into pancreatic acinar cells (AR42J) of rats. The rats with Lentiviral EGFP transfection were treated as negative control. The transfection efficiency was detected by inverted fluorescence microscope and flow cytometry. The EGFP LC3 protein expression in the stable cell lines were analyzed by Western blot. The cells were treated with thapsigargin to establish endoplasmic reticulum stress model, and the LC3, PERK protein expressions were detected by Western blot. ResultsThe transfection efficiency of Lentiviral EGFP LC3 of AR42J cell was >85%, which could achieve stable passage. The expression of LC3 mRNA of AR42J cells transfected with Lentiviral EGFP LC3 was 9.14±0.32 folds higher than that of negative control, which had no expression of LC3 protein, only EGFP expression. However, compared with non-transfection group, the LC3 mRNA expression in EGFP group was not significantly different. ConclusionsA pancreatic acinar cell line (AR42J) of rat stably expressing EGFP LC3 protein is successfully constructed. And it may provide a new model for further research of the relationship between acute pancreatitis and autophagy.

【Key words】Lentivirus infections;Autophagy;Cell line;AR42J cell

自噬是细胞内过多或异常的细胞器及其周围的蛋白质和部分细胞质被双层膜所包裹形成自噬体，自噬体与溶酶体融合并且降解其所包裹的内容物，随后降解产物(如氨基酸)反向循环至细胞质的过程。通常细胞内自噬维持在很低的水平，在应激条件下可被诱导，它在细胞内具有各种各样的功能[1-3]。LC3是酵母自噬相关基因ATG8的类似物，当哺乳动物细胞发生自噬时细胞质内LC3由可溶形式LC3(LC3-Ⅰ)转变为脂溶形式LC3(LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ能够与新形成的自噬体膜结合。检测细胞中LC3Ⅱ含量的变化可以判断自噬的变化。因此，本研究利用过表达LC3的慢病毒载体Lentiviral-EGFP-LC3转染大鼠胰腺外分泌细胞AR42J，并通过模拟内质网应激来诱导自噬的发生，以明确在AR42J细胞进行自噬研究的可能性，为进一步研究急性胰腺炎与自噬的关系提供稳定的细胞模型。

作者单位：200433上海，第二军医大学长海医院消化内科

通信作者：湛先保，Email：zhanxianbao @126.com

材料与方法

一、材料、试剂和仪器

Lentiviral-EGFP-LC3慢病毒载体及阴性对照慢病毒载体Lentiviral-EGFP由第二军医大学微生物教研室提供。AR42J细胞由本实验室保存。胎牛血清购自美国Gbico公司、1640培养基购自美国Thermo公司；小鼠抗大鼠β-actin单抗购自杭州华安生物技术有限公司、小鼠抗大鼠GFP单抗购自美国Abcam公司、兔抗大鼠LC3单抗购自美国CST公司、兔抗大鼠PERK多抗购自美国Santa-Cruz公司；DMSO、毒胡萝卜素购自美国Sigma公司；ECL化学发光显影液购自美国Thermo公司；倒置荧光显微镜购自日本OLYMPUS公司；流式细胞分析仪购自德国Miltenyi公司；ABI7500型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

二、方法

1．慢病毒包装及滴度检测：人源胚胎肾细胞(HEK293T细胞)由本实验室提供，常规培养传代。取对数生长期细胞，以2.5×106个细胞密度接种于10 cm培养瓶，置37℃、5% CO2培养箱过夜。感染前2至3 h更换新鲜培养基，将Lentiviral-EGFP-LC3、包膜质粒pCMV-VSV -G、包装质粒pCMV-Dr8.2dvpr(均为美国SIGMA公司产品)与HEK293T细胞共孵育24 h，按说明书操作。以Lentiviral-EGFP感染作为阴性对照，慢病毒包装后置-80℃冰箱保存[4]。两种病毒分别命名为EGFP-LC3病毒及EGFP病毒，并运用稀释梯度法检测病毒滴度。

2．慢病毒感染：AR42J细胞接种于含10%胎牛血清的1640培养基中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞，制备成1×105个/ml细胞悬液。在24孔板中每孔加入500 μl细胞悬液，即每孔5×104个细胞，培养过夜。AR42J细胞分为未感染组、EGFP病毒感染组(EGFP组)、EGFP-LC3病毒感染组(EGFP-LC3组)。

分别取两种病毒液，加入培养液混悬，病毒滴度为1×108TU/ml，再加入终浓度为7 μg/ml的聚凝胺(polybrene)，混匀后加入到相应组的AR42J细胞中，常规培养24 h，随后更换培养液。48 h后在倒置荧光显微镜下任意选取10个视野，分别于10倍镜、20倍镜下观察GFP表达效率，同时取50 μl细胞悬液上流式细胞分析仪检测感染效率。

3．细胞GFP、LC3蛋白表达检测：收集未转染组、EGFP组、EGFP-LC3组细胞，应用RIPA裂解液匀浆细胞，提取蛋白，定量后取50 μg常规行蛋白质印迹法检测细胞GFP、LC3蛋白的表达，以β-actin为内参。小鼠抗大鼠GFP单抗稀释浓度为1∶1 000，兔抗大鼠LC3单抗稀释浓度为1∶1 000，内参小鼠抗大鼠β-actin单抗稀释浓度为1∶1 000；HRP标记二抗稀释浓度1∶5 000。最后ECL发光，X线胶片曝光、显影、定影。

4．细胞LC3 mRNA表达检测：收集未感染组、EGFP组、EGFP-LC3组细胞，用Trizol提取细胞总RNA，应用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。再按PCR试剂盒扩增LC3 mRNA。LC3引物上游为5′-CGGAGCTTTGAACAAAGAGTGG-3′，下游为5′-CTCTCTCACTCTCGTACAC-3′，扩增产物177 bp，由上海Invitrogen公司合成。PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环。通过PCR仪自带分析软件获取Ct值，应用公式2-△△Ct计算LC3 mRNA相对表达量，以未感染组细胞的表达量为1。

5．内质网应激模型建立及评估：将稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞以每孔5×105个细胞密度接种于6孔板中，培养过夜后分为未处理组及毒胡萝卜素(TG)处理组，TG处理组加入1 μmol/L的毒胡萝卜素处理12 h。收集两组细胞，提取细胞蛋白，取50 μg蛋白常规行蛋白质印迹法检测LC3、内质网应激相关基因PERK蛋白的表达，以β-actin为内参。兔抗鼠PERK多抗稀释浓度为1∶400，其他操作同上。应用图像分析仪扫描，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白的相对表达量。

三、统计学处理

结　　果

一、AR42J细胞的病毒感染率及其传代的稳定性

感染48 h后荧光显微镜下观察，两组病毒感染的AR42J细胞绝大多数胞质内可见荧光蛋白GFP(图1)，流式细胞分析仪检测到两组病毒感染细胞的感染效率均在85%以上(图2)。阳性表达的细胞经10次传代培养，未见GFP荧光衰减，表明病毒感染的AR42J细胞能稳定地传代。

图1　Lentiviral-EGFP-LC3感染的明视野(1A)及暗视野荧光图(荧光显微镜　×20)

FSC是前向角散射，SSC是侧向角散射，A为细胞荧光的总和 图2　Lentiviral-EGFP-LC3感染(2A、2B)及Lentiviral-EGFP 感染(2C、2D)的 AR42J细胞EGFP表达 (流式细胞分析仪)

二、AR42J细胞的LC3 mRNA表达

未感染组的LC3 mRNA的表达量为1，EGFP组、EGFP-LC3组细胞的LC3 mRNA表达量分别为未感染组细胞的 (1.08±0.07)、(9.14±0.32)倍。EGFP-LC3组的表达量显著高于未感染组，两组间差异有统计学意义(F=7.293，P<0.01)，而EGFP组与未感染组间的差异无统计学意义。

三、稳定表达细胞系的GFP、LC3蛋白表达

未感染组无GFP、LC3蛋白表达。EGFP组、EGFP-LC3组细胞有GFP蛋白的表达。EGFP-LC3组细胞还有EGFP-LC3融合蛋白表达(图3)。

图3　未感染组(1)、EGFP组(2、3)、EGFP-LC3组(4、5)AR42J细胞的GFP、LC3、GFP-LC3蛋白的表达

四、内质网应激模型的AR42J细胞LC3、PERK蛋白的变化

未处理组与TG处理组AR42J细胞均可检测出LC3、PERK的表达(图4)。两组LC3及PERK蛋白相对含量LC3-Ⅰ为0.273±0.01、0.176±0.03，LC3-Ⅱ为0.156±0.03、0.546±0.04，PERK为0.284±0.02、0.648±0.06。表明TG处理组细胞中LC3-I向LC3-Ⅱ转变，PERK蛋白的表达较未处理组显著增加，差异有统计学意义(F值分别为56.14、386.96、150.84，P<0.01，图4)。

图4未处理组(1)、TG处理组(2)的Lentivard-EGFP-LC3感染的AR42J细胞的LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、PERK蛋白的表达

讨　　论

自噬参与细胞的生理活动，例如细胞的生长和分化。自噬还可能参与调节一些人类疾病的过程，例如癌症、肌肉疾病和神经退行性疾病。它还可以作为一种细胞防御机制防止某些病原菌和病毒的感染[5-6]。自噬是一个受到紧密调控的过程，它在细胞生长、发育和动态平衡过程中起着重要的作用。因此构建适合的细胞模型对于后续的实验研究尤为重要。

自噬体的形成由一系列自噬相关基因(autophagy-related genes，ATG)的产物组成的复合物参与协调[7-8]。ATG编码的蛋白质至少组成4种复合物，它们各自控制自噬体形成过程中单独的环节。例如，ULK1/Atg1参与自噬体的成核，Beclin1/Atg6-Vps34和Atg5-Atg12-Atg16复合物参与隔离膜的形成[9-10]。

大鼠胰腺外分泌细胞对于研究急性胰腺炎的分子机制是一种重要的细胞模型。既往一些研究证实，利用瞬时转染技术可以使外源性基因的表达在24～48 h内达到高峰，然而随着时间的推移，由于细胞裂解等因素的影响，可能会引起外源性基因的缺失，对实验的准确性产生影响。同时稳定转染后细胞可持续传代，既提高了实验的准确性，又降低了多次转染的试验成本。因此，构建稳定表达EGFP-LC3融合蛋白的AR42J细胞可以保证细胞的持续性以及后续实验的准确性。

本实验采用慢病毒过表达载体包装慢病毒以感染AR42J细胞，通过倒置荧光显微镜观察以及流式细胞分析仪对稳定传代的细胞进行检测，绿色荧光蛋白的表达在85%以上。再利用蛋白印迹法检测细胞中EGFP-LC3融合蛋白的表达，结果表明细胞中成功表达EGFP-LC3融合蛋白。同时建立TG诱导的内质网应激模型，蛋白印迹法检测显示LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变明显。以上表明在AR42J细胞系中可通过TG诱导内质网应激模型的建立，同时表明在AR42J细胞中，内质网应激后可引起自噬的变化。此外，在小鼠RAW264．7细胞系、成神经瘤细胞系等均观察到一致的结果。此次建立稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系，为下一步研究急性胰腺炎与自噬关系提供了重要的研究模型。

参考文献

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[7]Nishida Y, Arakawa S, Fujitani K, et al. Discovery ofAtg5/Atg7-independent alternative macroautophagy[J]. Nature, 2009, 461(7264): 654-658.

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[10]Mizushima N, Yoshimori T, Ohsumi Y. The role of Atg proteins inautophagosome formation[J].Annu Rev Cell Dev Biol, 2011, 27: 107-132.

(本文编辑：吕芳萍)

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