高原低氧环境下急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺及肝脏损害的研究

·论著·

高原低氧环境下急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺及肝脏损害的研究

朱海宏袁冬林吴新民郭亚民叶谢智华叶成杰

【摘要】目的观察高原低氧环境下急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺及肝功能损害程度，为临床更好地诊治高原地区重症急性胰腺炎(SAP)患者提供参考。方法96只SPF级雄性Wistar大鼠分别在海拔1 500、3 300、4 300 m高度进行实验。采用胰腺被膜下注射牛磺胆酸钠的方法制备ANP模型，以仅翻动胰腺数次后关腹的大鼠作为假手术组。假手术组在术后6 h处死，ANP组在造模后6、12、24 h分批处死。取血检测血清淀粉酶活性，取胰腺及肝脏常规行组织病理学检查，并进行病理评分。结果假手术组大鼠的血清淀粉酶活性无明显变化，胰腺及肝脏无明显组织病理改变。同一海拔高度，ANP组各时间点大鼠的血清淀粉酶活性、胰腺及肝脏病理评分均显著高于假手术组，ANP 12、24 h组大鼠的血清淀粉酶活性、胰腺及肝脏病理评分均显著高于ANP 6 h组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。海拔3 300、4 300 m高度的ANP各时间点组大鼠的胰腺及肝脏病理评分均显著高于海拔1 500 m高度的同时间点组大鼠，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，但血清淀粉酶活性的差异无统计学意义。结论随着海拔高度的增加，ANP大鼠的胰腺及肝脏的病理损害呈持续性加重。

【关键词】胰腺炎，急性坏死性；高原；缺氧；大鼠；肝损伤

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.008

基金项目：青海省科技厅资助项目(2002-N-122)；青海省科技厅应用基础资助项目(2014-ZJ-745)

收稿日期：(2014-12-17)

Pancreas and liver damage of acute necrotizing pancreatitis rats under hypoxia plateauZhuHaihong,YuanDonglin,WuXinmin,GuoYanmin,YeXiezhihua,YeChengjie.DepartmentofGeneralSurgery,People′sHospitalofQinghaiProvice,Xining810007,China

Correspondingauthor:WuXinmin,Email:zhuhaihong1214@126.com

Abstract【〗ObjectiveTo investigate the extent of pancreatic and liver function damage of acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats under altitude hypoxia environment, and to provide a reference for better diagnosis and treatment of severe acute pancreatitis (SAP) in the plateau region. MethodsNinety-six specific pathogen free (SPF) Wistar male rats were involved in 1 500 meters, 3 300 meters and 4 300 meters altitude. The model of ANP was established by using pancreatic capsule injection of sodium taurocholate (Na-Tc). In the sham operation group, the rats′ belly was opened and closed after only flipping its pancreas several times. Rats in sham group were sacrificed at 6 h, and ANP group were sacrificed at 6, 12, 24 h after modeling. Serum amylase activity was measured, and pancreas and liver tissue were harvested for pathological examination and score. ResultsSerum amylase activity in sham operation group rats was not remarkably changed, and pathological changes of pancreas and liver were not obvious. At same altitude, serum amylase activity, pancreas and liver pathology score of ANP rats at each time point were significantly higher than those in the sham operation group; and serum amylase activity, pancreas and liver pathology scores of ANP 12, 24 h group rats were significantly higher than those of ANP 6h group; and the difference was statistically significant (P<0.05). At 3 300 meters, 4 300 meters altitude, the pancreas and liver pathology scores of ANP rats at each time point were significantly higher than those at 1 500meters altitude, and the differences were statistically significant (P<0.05), but the difference in serum amylase activity was not statistically significant.

作者单位：810007西宁，青海省人民医院普外科(朱海宏、吴新民、郭亚民、叶谢智华、叶成杰)；青海省格尔木市药品管理中心(袁冬林)

通信作者：吴新民，Email: zhuhaihong1214@126.com

ConclusionsWith the increase of altitude, pancreatic and liver pathological damage of ANP rats shows continuing aggravation.

【Key words】Pancreatitis, acute necrotizing;Plateau;Anoxia;Rats;Liver injury

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常见的消化系急症，多数属自限性。约15%～30%患者临床经过凶险，发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP),死亡率极高[1]。急性肝、肾、肺损伤是SAP最常见且严重的并发症, 但其发病机制尚未完全阐明[2]。 高原地区受缺氧、低气压等综合暴露因素影响，更增加了该病的许多不确定因素。为此，本研究在高原地区制备急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠模型，检测大鼠血清淀粉酶水平，观察大鼠胰腺及肝脏组织病理学的改变，探讨高原低氧环境下ANP大鼠的特征，为更好地诊治高原地区SAP患者提供参考。

资料与方法

一、实验动物及ANP模型制备

SPF级健康雄性Wistar大鼠96只，3～4月龄，体质量(200±20)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供。实验动物许可证号SCXK2004-0006，编号0000886。大鼠用北京科奥协力饲料有限公司提供的专用饲料喂养，自由摄食和饮水。按数字表法随机将大鼠置于3个海拔高度，即海拔1 500、3 300、4 300 m进行实验。每个海拔高度的大鼠再按数字表法随机分成假手术组及ANP 6、12、24 h组，每组8只。在海拔3 300、4 300 m实验的大鼠先在该高度适应20 d后再进行实验。

各组大鼠术前禁食12 h，自由饮水。用22%乌拉坦(4 ml/kg体质量)腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧固定于手术台上，消毒手术域。进入腹腔，分别在胰头、胰体以及胰尾部多点缓慢注射5%牛黄胆酸钠，总量为1 ml/kg体质量。假手术组在打开腹腔后仅翻动胰腺数次后关腹。大鼠清醒后自由饮水。保持环境温度>37℃。假手术组于术后6 h全部处死，ANP各组在相应时间点处死。解剖大鼠，观察胰腺、肝脏大体病理变化；经腹主动脉采血3 ml注入密封的促凝采血管中静置1 h，以3 000 r/min低温离心10 min，收集血清；取部分胰腺和肝脏组织浸泡于10%甲醛液固定备用。

二、检测指标

1．血清淀粉酶活性测定：应用日立7600全自动生化分析仪测定各组大鼠血清淀粉酶活性。

2．大鼠胰腺及肝脏组织病理学检查：固定的胰腺及肝脏组织常规石蜡包埋、切片，行HE染色。由两位病理科医师采用双盲法读片，并采用改良Grewal评分从水肿、坏死、炎症、出血4个方面对胰腺组织进行评分[3]。参考文献[4]的标准，在高倍镜下随机选取2个视野，观察肝细胞有无气球变性、脂肪变性、胞质凝聚、水样变性和细胞坏死等病变。肝细胞大致正常为0分，病变肝细胞占整个视野的1/4为1 分，占整个视野的2/4为2分，占整个视野的3/4为3分，占整个视野为4分。累计所观察视野的病变总分，其中肝细胞坏死以2倍评分计算[4]。

三、统计学处理

结　　果

一、血清淀粉酶活性变化

同一海拔高度，ANP各时间点组大鼠的血清淀粉酶活性均显著高于假手术组，ANP 12、24 h组大鼠的血清淀粉酶活性均显著高于ANP 6 h组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表1)。但假手术组及ANP各时间点组大鼠的血清淀粉酶活性在不同海拔高度的差异均无统计学意义(P值均>0.05，表1)。

二、胰腺组织病理改变

1．大体观察：假手术组大鼠胰腺光泽度良好，无水肿，胃肠无扩张，腹腔内无腹水。ANP 6 h组大鼠胰腺呈暗红色，无光泽，表面水肿，有的大鼠胰腺有出血，有腹水； 12 h组大鼠胰腺水肿、出血明显，胰腺及网膜组织有少量皂化斑，血性腹水形成； 24 h组大鼠有大量血性腹水，胰腺广泛出血、坏死，胰腺及网膜组织多处皂化斑，胃肠扩张，明显充血，肠内滞留大量液体。

2．组织病理学改变：假手术组大鼠胰腺腺泡结构正常，排列紧密；海拔1 500 m高度ANP 24 h组大鼠胰腺的叶间隙、腺泡间隙、细胞间隙均增宽，血管内充血，血管周围有炎细胞渗出；海拔3 300 m高度ANP 24 h组大鼠胰腺腺泡细胞空泡样变性，腺小叶结构破坏，大片出血，胰腺实质内可见散在的点片状坏死，腺泡间大量炎细胞浸润；海拔4 300 m高度ANP 24 h组大鼠胰腺大片坏死，有的整个小叶坏死，坏死区域腺泡结构消失，细胞玻璃样变、核溶解消失，胰周脂肪坏死(图1)。

表1　假手术组和ANP组大鼠不同海拔高度的血清淀粉酶活性变化 ± s)

注：与假手术组比较，aP<0.05；与同海拔高度ANP 6 h组比较，bP<0.05

图1　假手术组(1A)及海拔1 500(1B)、3 300(1C)、4 300 m(1D)高度ANP 24 h组大鼠的胰腺组织病理表现(HE　×100)

同一海拔高度，ANP各时间点组大鼠的胰腺病理评分均显著高于假手术组，ANP 12、24 h组大鼠的胰腺病理评分均显著高于ANP 6 h组；海拔3 300、4 300 m高度的ANP各时间点组大鼠的胰腺病理评分均显著高于海拔1 500 m高度的同时间点组大鼠，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表2)。

三、肝脏组织病理改变

1．大体观察：假手术组大鼠肝脏外观无明显变化。ANP 6 h组大鼠肝脏充血，部分肝脏出血；12 h组大鼠肝脏充血、出血加重；24 h组大鼠肝表面可见散在、可疑的坏死灶。

2．组织病理学改变：假手术组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞形态正常；海拔1 500 m高度ANP 24 h组大鼠肝窦大致正常，肝细胞胞质伊红染色变淡，范围略扩张，偶见嗜酸小体，部分肝细胞胞质出现小圆形空泡样变性(似脂肪变性)；海拔3 300 m高度ANP 24 h组大鼠肝细胞肿胀，个别小叶中央静脉周围肝细胞呈缺血样改变；海拔4 300 m高度ANP 24 h组大鼠肝脏出现坏死灶，灶内可见嗜酸性变肝细胞及肿胀巨噬细胞(图2)。

同一海拔高度，ANP各时间点组大鼠的肝脏病理评分均显著高于假手术组，ANP 12、24 h组大鼠的肝脏病理评分均显著高于ANP 6 h组；海拔3 300、4 300 m高度的ANP各时间点组大鼠的肝脏病理评分均显著高于海拔1 500 m高度的同时间点组大鼠，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表3)。

表2　假手术组和ANP组大鼠胰腺组织的病理评分 ± s)

注：与假手术组比较，aP<0.05；与同海拔高度ANP 6 h组比较，bP<0.05；与海拔1 500 m高度的同组比较，cP<0.05

图2　假手术组(2A)及海拔1 500(2B)、3 300(2C)、4 300(2D)高度ANP 24 h组大鼠的肝组织病理表现(HE　×400)

组 别海拔1500m海拔3300m海拔4300mF值P值假手术组0.40±0.090.42±0.110.50±0.091.960.175ANP 6h组0.95±0.05a1.27±0.20ac1.39±0.20ac11.270.005 12h组1.94±0.09ab2.34±0.35abc2.85±0.13abc25.17<0.005 24h组2.69±0.32ab3.32±0.31abc3.82±0.99abc27.54<0.005F值204.66140.70701.86P值<0.05<0.05<0.05

注：与假手术组比较，aP<0.05；与同海拔高度ANP 6 h组比较，bP<0.05；与海拔1 500 m高度的同组比较，cP<0.05

讨　　论

AP时，在各种致病因子的作用下，胰消化酶原，如弹力蛋白酶、激肽酶、脂肪酶等被激活，可破坏血管壁、扩张血管及增加血管壁通透性，引起出血、血栓形成及微循环障碍，导致胰腺缺血缺氧。微循环的改变是SAP早期重要的病理生理过程，它不仅仅发生于胰腺，而且涉及到众多器官诸如肝脏、肺脏和肠道等，肝脏的微循环的变化参与了肝组织损伤的发生发展过程[5]。

高原气候的主要特点是低气压、低氧分压、寒冷、干旱、多风、辐射强和温差大。在高原，大气压和氧分压随着海拔高度的增加而逐级降低[6]。高原低氧可激活凝血通路，抑制纤溶酶原活性，使血液呈高凝和低纤溶状态[7-8]。高原低氧可促使儿茶酚胺及肾素分泌增多，加之血液黏稠、无形失水较多和血液重分布等因素将加剧上述病理生理变化[9-10]。本研究结果显示，假手术组大鼠血清淀粉酶活性及胰腺组织结构并未随海拔高度的增高而发生变化。然而AP组大鼠的胰腺损伤却随着海拔高度的增高而加重，这与空气中氧含量的明显下降有关。

肝脏是人体内最重要的生物转化器官，其许多功能均需耗氧，缺氧必然影响其正常功能发挥。有研究报道[11]，海拔3 800～4 080 m地区的土生狗或藏系绵羊肝脏的肝细胞呈轻中度肿胀，部分肝细胞见脂肪变性或点状与小灶性肝细胞坏死，另外部分肝细胞内有胆色素沉着，电镜下除见肝细胞内结构肿胀与变性外，还可见贮脂细胞脂质有较多脂滴，部分呈空泡样或空圈化变，且随海拔的升高愈趋明显。此外，内毒素还可介导炎性因子的产生，激活凝血系统或使门静脉强烈收缩，使肝脏血灌流不足，肝细胞严重缺氧，肝脏正常代谢和解毒功能发生严重障碍[12]。本研究结果显示，AP组大鼠的肝脏损伤也随海拔高度的增高而加重。

因此，在高原环境下特别是随着海拔梯度的升高，人类全身各系统炎症反应明显加重。在高原环境下发生的AP尤其是SAP亦更加严重，应引起临床医师的重视。

参考文献

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[3]Grewal HP,Moheyel Din A,Graber L,et al. Ameliomoration of the physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti TNF-α polyclonal antibody[J]. Am J Surg, 1994, 167(1):214-218.

[4]Christensen C, Bruden D, Livingston S, et al. Diagnostic accuracy of a fibrosis serum panel (FIBROSpect II) compared with Knodell and Ishak liver biopsy scores in chronic hepatitis C patients[J]. J Viral Hepat, 2006, 13(10):652-658.

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[8]Martin DS, Pate JS, Vercueil A, et al. Reduced coagulation at high altitude identified by thromboelastography[J]. Thromb Haemost,2012, 107(6):1066-1071.

[9]Pichler Hefti J, Risch L, Hefti U, et al. Changes of coagulation parameters during high altitude expedition[J]. Swiss Med Wkly, 2010, 140(7-8):111-117.

[10]Rebibo L, Peltier J, Gerin O, et al.Unusual course of the aberrant right hepatic artery running through the pancreatic parenchyma during modified Frey′s procedure[J].Morphologie, 2014,98(323):182-186 .

[11]张彦博，汪源，刘学良,等.人与高原[M].西宁：青海人民出版社，1996，129-132.

[12]Elder AS, Saccone GT, Bersten AD, et al.Evaluation of lung injury and respiratory mechanics in a rat model of acute pancreatitis complicated with endotoxin[J]. Pancreatology, 2012, 12(3):240-247.

(本文编辑：吕芳萍)

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