维生素E缓解蛋鸡免疫应激的研究

■庞 洁 方 旭 王超群 宋子域 黄 岩 赵建国

（海南大学农学院，海南海口 570228）

1893年，德国莱比锡医生研究发现，蛋鸡免疫后卵黄中存在特异性抗体。然而，直到1996年，卵黄抗体技术才逐渐获得国际认可，研究领域不断扩展，在病原体诊断、饲料与食品添加剂、新药与兽药开发、食品工程及抗体技术等领域获得了广泛研究。当前，有关卵黄抗体的蛋鸡饲养、产蛋管理、免疫程序、提取程序、抗体特性鉴定等都获得了突破性进展。然而，制备卵黄抗体的蛋鸡免疫程序较为复杂，包括基础免疫、加强免疫和强化免疫三个阶段。高频注射免疫对蛋鸡造成的免疫应激往往造成生产性能下降[1]。免疫应激是指由于免疫操作而使蛋鸡受到强烈刺激或处于紧张状态下的非特异性全身反应，它是机体防御外界环境不良影响的一种生理生化表现。维生素E不仅是机体重要的脂溶性维生素，而且具有抗氧化、维持生育和调节免疫系统等诸多生物学功能[2]。本研究以开产至产蛋高峰期间蛋鸡为试验动物，研究免疫应激对蛋鸡生产性能、蛋品质以及免疫机能的影响，同时探讨日粮中添加不同水平维生素E对免疫应激的缓解作用，为卵黄抗体高效生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与管理

选取同批次、同条件饲养的19周龄，体重相近非免疫褐羽蛋鸡180只，饲养于海南大学秀英农场。鸡舍封闭，配有控温调湿设备，按常规程序卫生消毒，每日采光良好，人工定期清粪。饲养方式采用3层立体笼养，每笼1只鸡，全天不间断自由饮水，统一饲喂标准日粮，自由采食，分别在上午8:30和下午4:30饲喂，正式试验时间60 d，其中预饲期7 d，鸡群健康状况良好，产蛋状况均正常。基础日粮组成及其营养水平含量见表1，由海南正大公司按试验要求生产。维生素E由海南正大公司提供，生产批号：VX1403122410。

表1 蛋鸡基础日粮组成及营养水平(干物质基础）

1.2 免疫疫苗与程序

猪乙型脑炎弱毒苗：毒株为SA14-14-2，湖南中岸生物药业有限公司生产，批准文号：兽药生字（2015）180021080，-15 ℃保存，有效期18个月。规格：每瓶10头份，每头份病毒含量≥105-7TCID50。疫苗稀释液为磷酸盐缓冲稀释液，随疫苗购买。

免疫方法：选取蛋鸡左、右胸部为注射部位，注射器应与胸骨成平行方向，针头与一侧胸肌成30度角插入肌肉，避免刺入内脏，根据注射剂量合理分点分配注射。免疫时间为下午4：00，操作时动作轻微，每只鸡一个针头。

免疫程序：首免10 d后，每隔10 d进行加强免疫，最后一次为强化免疫，具体见表2。

表2 猪乙脑卵黄抗体蛋鸡免疫程序

1.3 试验设计

将180只蛋鸡随机分成6组，每组30只。19周龄分组并配制日粮，同时记录生产性能，20周龄开始饲喂不同水平维生素E试验日粮。对照组整个试验期间，正常饲养，无免疫应激，日粮中添加维生素E 30 mg/kg。试验组1～5按照免疫程序注射乙脑疫苗，维生素E添加水平依次为30、60、90、120 mg/kg和150 mg/kg。

1.4 测定指标

蛋鸡不良反应发生率(%)=(每组注射部位表现轻微肿胀蛋鸡数/每组蛋鸡总数×免疫次数)×100；

死淘率(%)=每组死亡蛋鸡数量/每组蛋鸡总数×100；

日产蛋率(%)=日产蛋总数/蛋鸡总数×100；

平均耗料量(g/只)=(投料量-剩余料量)/蛋鸡总数；

平均蛋重(g/个)=总蛋重/总蛋数；

料蛋比=耗料量/总蛋重；

蛋壳厚度(mm)：蛋壳厚度仪测定；

蛋黄比率(%)=蛋黄重/蛋重×100；

蛋黄提取与效价检测：分别于免疫前一天、免疫后第10、20、30、40、50 d和60 d在各试验组取10枚鸡蛋，每枚鸡蛋吸取5ml蛋黄，加入等量生理盐水做1∶1稀释，然后加入等量氯仿萃取30 min，4℃、5 000 r/min离心5 min，吸出上层水相用于抗体检测。抗体效价检测方法为加入pH值为9.0硼酸盐缓冲液于清洁干燥96孔V型微量板中，每孔25 μl；再加入25 μl 1∶10血清于清洁干燥96孔V型微量板第1孔，依次2倍倍比稀释，充分混匀，最后一孔弃掉25 μl。再于每孔中加入4单位血凝素25 μl，充分混匀，加盖置室温1 h；最后于每孔中加入50 μl 0.5%的鹅红细胞悬液，充分混合，室温1 h后观察结果。结果判定：HI效价大于1∶20判为阳性。试验孔全部呈现+++～++++的红细胞凝集为阴性结果，阳性结果以++凝集孔稀释倍数作为该份血清的终点抑制效价。

1.5 数据处理

试验数据用“平均数±标准误”表示，数据统计采用SPSS14.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 维生素E缓解免疫应激对蛋鸡健康状况的影响

试验期间，各试验组均有蛋鸡注射部位出现轻微肿胀，试验组1～5不良反应发生率依次为1.3%、0.7%、0.7%、1.3%和0.7%，静脉注射未见异常，各组死淘率均为0。Sunder等认为维生素E用于蛋鸡生产安全范围较广[3]。试验中蛋鸡日粮添加维生素E范围为30～180 mg/kg，未见蛋鸡异常反应。张丹俊等认为出现不良反应是由于个别蛋鸡（过敏性体质）对注射疫苗应激反应不同，注射疫苗后机体易发生局部炎症反应或较强烈的毒副应激反应[4]。实际上，不良反应发生与死亡多与蛋鸡体质与注射方法有关。试验中发现不良反应多发生于首次胸肌免疫注射，症状不久就自行消失。蛋鸡免疫过程中造成死亡的原因多与注射过深或刺破肝脏出血导致鸡急性死亡有关。本次试验过程中蛋鸡不良反应发生率和死淘率均较低，说明日粮中维生素E添加量对蛋鸡健康状况无负面影响。同时，该免疫程序对蛋鸡健康状况影响轻微，可以作为生产卵黄抗体免疫程序。

2.2 维生素E缓解免疫应激对蛋鸡生产性能的影响(见表3)

表3 维生素E缓解免疫应激对蛋鸡生产性能的影响

试验组1与对照组比较，产蛋率下降9.17%，日采食量下降7.44 g/(d·只)，料蛋比提高0.11，差异显著（P＜0.05）。可见，免疫应激对蛋鸡生产性能的影响较大，导致产蛋率下降，料蛋比提高。由于免疫过程中蛋鸡易受到惊吓，导致生长、繁殖和免疫机能下降。因此，蛋鸡表现生长缓慢，产蛋量下降，饲料利用率降低。王传强等认为一般单次免疫且免疫间隔时间较长，产蛋鸡群体质良好、疫苗注射方法正确的情况下，较少出现产蛋下降等不良反应[1]。首次免疫过程中，蛋鸡采食量下降（3%左右），饮水正常，产蛋量下降（3%左右），3 d后恢复正常。由于本试验在60 d内间隔6次进行免疫注射，属于高频免疫，对蛋鸡影响较大，生产性能下降。试验组1至试验组5随着维生素E添加量的增加，蛋鸡的产蛋率与采食量变化较小，差异不显著(P＞0.05)。这个结论与呙于明等研究日粮中添加不同水平维生素E对蛋鸡的采食量、饲料转化率无显著影响结论相似[5]。张桂芝等认为，随着蛋鸡年龄的增长，机体自身抵抗力增强，维生素E通过增强机体免疫力而提高生产性能的作用减弱[6]。本试验所选用的蛋鸡，其自身的生产性能已经趋于稳定，因此维生素E添加水平对其影响不明显。

2.3 维生素E缓解免疫应激对蛋鸡蛋品质的影响(见表4)

表4 维生素E缓解免疫应激对蛋鸡蛋品质的影响

免疫应激打乱了鸡群正常产蛋规律，容易造成腹中鸡蛋破裂、腹膜炎等病症。破蛋率与蛋黄比重是卵黄抗体生产过程中两个比较重要的参数。各试验组与对照组比较，蛋重、蛋壳厚度、蛋黄比率三项指标差异均不显著（P＞0.05）。表明维生素E对免疫应激状态下的蛋品质缓解作用不明显。生产中，蛋品质受很多因素的影响，除了品种和遗传等原因之外，营养因素影响最大。刘世发等研究免疫应激对蛋鸡钙磷代谢的影响中认为免疫应激对蛋壳品质和钙磷代谢无显著影响[7]。因此维生素E的缓解作用并不明显。

2.4 维生素E缓解蛋鸡免疫应激对乙脑卵黄抗体产生规律的影响(见表5)

由表5可知，各试验组免疫前一天，乙脑抗体效价均为0。免疫后第10、20 d检测卵黄抗体效价各试验组之间差异不显著（P＞0.05）。免疫后40、50 d和60 d检测卵黄抗体效价，试验组4、5与试验组1、2、3比较差异显著（P＜0.05），但是组间差异不显著（P＞0.05）。试验组 1、2、3，60 d 抗体平均效价分别为6.5log2、6.4log2和6.5log2，差异不显著（P＞0.05）。试验组4与5抗体效价分别为7.2log2和7.3log2，两组之间差异不显著(P＞0.05)，但与试验组1、2、3比较差异显著（P＜0.05）。表明日粮中添加维生素E 120 mg/kg或150 mg/kg对蛋鸡体液免疫有促进作用。维生素E作为免疫调节剂可以缓解各种应激引起的不良影响。韩慕俊等研究指出，蛋雏鸡饲粮中维生素E水平在40 IU/kg以上时可以提高血液中新城疫、禽流感的抗体滴度[8]。陈艳君等研究指出，饲粮中维生素E添加量为15 IU/kg时新城疫抗体滴度最高[9]。

表5 维生素E缓解蛋鸡免疫应激对乙脑抗体产生规律的影响（log2）

3 讨论

维生素E是动物机体不可或缺的脂溶性维生素，具有促进蛋鸡繁殖性能，提高产蛋率、抗氧化、促免疫，增强抗应激、抗病能力的作用。蛋鸡饲料中应用最为广泛的商品维生素E是含量为50%的DL-α-生育酚醋酸酯。以生产卵黄抗体为目的蛋鸡生产过程中，免疫应激是不可避免的。蛋鸡处于免疫应激时期对维生素E的营养需求量应综合考虑蛋鸡品种、饲养环境、基础营养水平等综合因素，是近年来研究的热点。韩慕俊等研究表明，在没有应激因素存在时蛋鸡日粮中维生素E需要量是很低的，免疫应激的强度不大而且时间不长，只能导致短时间的采食量下降，对生产性能没有太大的影响[8]。美国NRC（1994）推荐蛋鸡维生素E的最低需要量为5 mg/kg。我国农业部《饲料添加剂安全使用规范》对蛋鸡饲料维生素E推荐剂量为10～30 mg/kg，主要是用于促进蛋鸡繁殖性能，提高产蛋率。另有研究发现，蛋鸡饲料中添加大剂量维生素E，可以使蛋鸡体内抗体水平升高，吞噬细胞功能增强。给肉仔鸡饲喂维生素E，可以提高机体对气管炎病毒、绵羊红细胞和新城疫病毒的体液免疫效果[10-12]，在肉仔鸡日粮中添加80 IU/kg维生素E，感染性卵黄囊病毒的细胞免疫效果最佳[13]。大多数研究者认为维生素E毒性轻微，在非应激状态下，高剂量的维生素E虽然对蛋鸡生产性能和蛋品质无影响，但有可能抑制禽类免疫系统。因此，不可任意加大维生素E添加量。本试验添加维生素E范围为30～150 mg/kg主要是兼顾蛋鸡繁殖机能与免疫机能。

4 结论

高频免疫程序可导致蛋鸡生产性能下降，日粮中添加30～150 mg/kg维生素E对缓解蛋鸡生产性能与蛋品质影响不大，120或150 mg/kg维生素E可以有效提高蛋鸡抗体效价。