UPLC-MS/MS同时测定配合饲料中6种水溶性维生素的含量

■梁玉树 易锡斌 何开蓉 何芸芸 张丽萍 李良春

（1.西南科技大学材料与化学工程学院，四川绵阳 621000；2.新希望六和股份有限公司，山东青岛 266555；3.四川新希望畜牧科技有限公司，四川成都 610017；4.四川理工学院材料与化学工程系，四川自贡 643000）

维生素是生物体维持生命活动所必需的一类有机化合物，在生物体生长、代谢和发育过程中发挥着重要作用。水溶性维生素主要包括硫胺素（VB1）、核黄素（VB2）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、生物素（VB7）、钴胺素（VB12）等。随着人们日益增长的畜禽消费需求、畜牧业的迅速发展，畜禽养殖逐渐规模化、集约化、专业化，畜禽的营养和健康越来越受到重视。维生素作为维持动物机体健康的重要营养元素，在畜禽饲料中是不可或缺的。饲料中的各种维生素的量必须达到动物体的需要量，才能保证动物维持体内营养平衡，达到健康生长，因此加强饲料中维生素含量检测是确保饲料产品品质的基本途径，开发准确、便捷的测定方法将成为一项重要的研究课题。维生素检测方法有光度法、微生物法、酶标法等。随着科技的发展，仪器分析法相继建立，国家标准建立了各种水溶性维生素检测方法-高效液相色谱法，样品前处理繁琐耗时，针对饲料中的含量低于20 mg/kg水溶性维生素无法检测，并且干扰较大，无法准确定性和定量。

近年采用高效液相色谱同时测定水溶性维生素的文献较多，E.E.Abano等评述了1980～2014年采用高效液相色谱同时测定水溶性维生素的部分文献，Kamman等采用高效液相色谱同时测定维生素B1和维生素B2。Gatti等采用液相色谱荧光检测器检测了牛奶和药片中的VB6、VB2。Heudi等采用反相高效液相色谱分离预混饲料中的水溶性维生素并用紫外检测器检测其含量。Lebiedzinska等采用反相液相色谱电化学库伦检测器及紫外检测器检测了动植物食品中的 VB1、VB6、VB12。Vidovic等采用高效液相色谱测定了多种维生素糖浆中的水溶性维生素及防腐剂含量。Ciulu等采用反相高效液相色谱法测定了蜂蜜、干果蔬菜中的水溶性维生素。Andreas E.Karatapanis等研究了水溶性维生素在单柱高效液相色谱中的分离状况，Israel Olusegun Otemuyiwa等采用高效液相色谱法测定同时测定食品中水溶性维生素。Baifen Huang等报道了采用超高压液相色谱-串联质谱同时测定了强化婴儿食品中4种水溶性维生素。莫彩娜等报道了采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定配合饲料中维生素B1和维生素B2的方法。梁波报道了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定功能饮料中VB1、VB3、VB6、VB12以及VC含量的方法。然而，针对低含量、成分复杂、干扰较多的配合饲料样品中6种水溶性维生素含量的同时检测未见研究报道。本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时检测6种水溶性维生素的检测方法，应用于配合饲料及预混料中6种水溶性维生素的定性定量检测，将提高维生素的检测效率和准确性，在高效、低成本检测饲料中维生素含量方面具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1260-6460液相色谱—三重四极杆串联质谱联用仪配电喷雾离子源[ESI（美国安捷伦公司）]，AB-135型电子分析天平（梅特勒托利多上海有限公司）；LD5-2B离心机（北京京立离心机有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；旋涡混匀器MS3（德国IKA）。

乙睛、甲醇(色谱纯，默克公司)；甲酸、乙酸铵、氨水(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；氢氧化钠、氯化钠(分析纯，上海国药集团)；硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、钴胺素(含量99.5%，sigma公司)。

鱼料、肉鸡料、仔猪料、蛋鸡料、乳猪料和种猪料样品由四川新希望畜牧科技有限公司提供。

标准物质储备溶液：准确称取适量的硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、生物素、钴胺素标准品，用0.02 mol乙酸铵(pH=4.0)配制质量浓度为1 000.0 mg/l标准溶液。

标准物质工作中间液：准确分别移取适量标准溶液，配制成质量 VB1、VB3浓度为 1 mg/l，VB2、VB7、VB12浓度为 10 mg/l，VB6为 0.5 mg/l的混合标准工作中间液。

标准物质工作液：吸取一定体积的标准物质工作中间液，配成浓度以VB6计，浓度分别为1、2、5、10、20 μg/l标准物质工作液。

0.02 mol/l乙酸铵溶液（pH=4.0）：称取1.54 g乙酸铵于1 L容量瓶中，加适量超纯水超声溶解，定容至刻度。用乙酸调节pH值为4.0，用0.45 μm水相滤膜，过滤备用。

1.2 样品处理

称取饲料样品0.5～2 g于100 ml容量瓶中，加入20 ml 0.02 mol/l乙酸铵溶液，超声提取20 min，冷却定容，离心，用0.22 μm水相滤膜，过滤上机。

1.3 色谱与质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Capcell PAK ADME(2.1 mmI.D×150 mm，3 μm)；流动相A：含0.1%甲酸甲醇溶液；流动相B：0.02 mol/l乙酸铵溶液，采用梯度洗脱程序，流速为0.3 ml/min；梯度条件为：100%B；0～12 min，100%～10%B；12～14 min，10%B；14.01 min，100%B。

1.3.2 质谱条件

试验采用甲醇溶解6种水溶性维生素分别对其进行母离子、子离子全扫描，得到离子流图谱如图1。

图1 6种水溶性维生素全扫描的离子流

ESI正离子扫描模式：多反应监测（MRM）参数：干燥气温度325℃，干燥气流速9 L/min，雾化气压力45 psi，鞘气温度300℃，流速11 L/min，毛细管电压3 500 V，喷嘴电压500 V,其他质谱优化条件如表1所示。

表1 MRM监测模式下6种水溶性维生素的仪器优化条件

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

比较水、0.02 mol/l甲酸铵（pH=4.0）、0.02 mol/l乙酸铵（pH=4.0）、20%甲醇水溶液几种提取剂分别对样品提取的效果。上机检测均能得到很好的分离，但日间重现性有显著差异，其中用0.02 mol/l甲酸铵（pH=4.0）、0.02 mol/l乙酸铵（pH=4.0）重现性好，如图2。然而，用0.02 mol/l乙酸铵水溶液的作为流动相时，其各组分响应值达到最优，故选择用0.02 mol/l乙酸铵（pH=4.0）作为样品提取液。

2.2 样品提取时间的选择

称取样品，加入0.02 mol/l乙酸铵（pH=4.0），超声提取0～30 min，以每5 min为时间间隔点，比较得出超声时间以20 min为宜。

图2 几种提取溶剂稳定性比较

2.3 色谱柱与流动相的选择

由于水溶性维生素有较强的极性，分别用C18-MGⅡ(pH 2～10)3 μm 2.0 mmI.D.×150 mm 柱、C18-MGⅢ(pH 2～10)3 μm 2.0 mmI.D.×150 mm柱、ADME(pH 2～10）3 μm 2.1 mmI.D.×150 mm柱、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1×50 mm柱、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm 3.0×50 mm柱和Waters ACQUITY UPLC BEH 1.7 μm 2.1×50 mm柱，比较其分离效果，得出ADME(pH 2～10）3 μm 2.1 mmI.D.×150 mm柱对水溶性维生素有很好的保留。

2.4 线性范围、定量限、加标回收率及相对标准偏差

2.4.1 线性范围

配制与待测样品相同基质的混合标准系列工作液，使其浓度为分别1、2、5、10、20 μg/l，以选定的定量离子峰面积对质量浓度做标准曲线，6种水溶性维生素在仔猪料、育肥猪料、肉仔鸡料、蛋鸡料、肉鸭料基质中的线性方程及相关系数如图3所示。结果显示，在不同基质中，6种水溶性维生素在1～20 μg/l范围内的线性相关系数（r2）为0.996～0.999，表明线性相关性良好。

图3 6种水溶性维生素标准曲线及相关系数

2.4.2 检出限和定量限

采用空白样品中添加目标化合物的方法按1.2节样品提取与净化进行处理后上机分析，以VB6计，浓度为1 μg/l得出的SNR如图4所示。以3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比确定定量下限，通过计算得出6种水溶性维生素的检出限和定量限如表2所示。

图4 信号噪音

2.4.3 加标回收率

在溶剂空白中分别加入不同浓度的目标维生素标准品，按照1.2节中样品前处理方法进行处理，上机检测其浓度，计算加标回收率，加标量、回收率及相对偏差如表2所示（n=6）。

2.5 实际样品的测定

表2 加标回收率、相对偏差、检出限及定量限

应用上述方法对鱼料、肉鸡料、仔猪料、蛋鸡料、乳猪料和种猪料样品进行检测，几种饲料样品中均能检测出 VB1、VB2、VB3、VB6、VB7、VB12，其中 VB1的含量为3 731～8 939 μg/kg，VB2含量为8 860～14 880 μg/kg，VB3的含量为 6 744～14 720 μg/kg，VB6的含量为2 293～7 136 μg/kg，VB7含量为 356～457 μg/kg，VB12含量为339～485 μg/kg。证明该方法切实可行。本方法能够满足配合饲料同时检测6中水溶性维生素的需求。

3 结论

本文建立了应用UPLC-MS/MS同时检测鱼料、肉鸡料、仔猪料、蛋鸡料、乳猪料和种猪料中6种水溶性维生素的分析方法。研究表明，6种水溶性维生素加标回收率为83.5%～106.4%，相对标准偏差(n=6)为3.5%～9.1%，各水溶性维生素的检出限为0.05～1.97 μg/kg，定量下限为0.16～6.50 μg/kg。方法快捷、操作简单、节能环保、结果准确，符合相关法律法规的要求，满足日常检测需要。