牧草缩合单宁对大肠杆菌细胞壁脂肪酸的影响

■刘秀丽 金 龙 李 锋 裴 乐

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；2.加拿大农业与农业食品部列桥研究中心，加拿大列桥T1J 4B1；3.东北农业大学动物科学与技术学院，黑龙江哈尔滨 150030）

植物单宁(Tannins)是一类普遍存在的多酚类化合物，根据来源不同具有不同的抗生活性。如紫色达利菊牧草缩合单宁含量很高[1]，长期饲喂可以减少反刍动物粪中大肠杆菌O157：H7的排出，降低环境污染。研究也显示，从9种牧草中分离的缩合单宁，仅仅是紫色达利菊单宁表现出了较强抗E.coliO157：H7活性的作用[2-3]。

据报道，儿茶酚素-绿茶中单宁单体的抗大肠杆菌活性是由于对细菌细胞膜脂质层的破坏和外膜通透性的增加而起作用；从叶白千层（茶树）中分离的精油、百里香酚等酚提取物都是通过改变细菌细胞外膜和脂质层构成而对革兰氏阴性菌产生抑制作用。在香精油中酚类化合物的抗微生物活性似乎是与羟基的存在和微生物酶的失活有关，但最可能是和细胞膜相关的这些基团引起了细胞成分如脂肪酸和磷脂的改变[4]，从而减弱细胞的能量代谢和影响遗传物质的合成。本试验目的就是了解单宁作用于细菌细胞后，细胞壁脂肪酸组成的变化，为阐明紫色达利菊所含缩合单宁抑制大肠杆菌的作用机理提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

1株非致病性大肠杆菌ATCC25922，来自加拿大农业部莱斯布里奇研究中心（Lethbridge research cen-tre culture collection.Canada）的微生物培养室。

1.1.2 紫色达利菊和红豆草单宁

紫色达利菊单宁和红豆草单宁系加拿大农业部莱斯布里奇研究中心反刍动物营养实验室提取，纯度均大于98.0%。

1.1.3 所需主要仪器设备

气相色谱仪（Hewlett Packard GC System 6890,Mississauga,ON,Canada）；OxiSelect™ Hydrogen Peroxide Assay Kit(Colorimetric，STA-343，Cell biolabs，Inc)；冻干机（Goldfisch Apparatus，Laboratory construction Co.,Kansas City,Mo.USA)；紫外分光光度计（Metertech INC，SP-8001）；氮气吹扫仪（OA-SYS heating evaporator 24 needles,N-EVAPTM112.USA）；高速离心机(Sorvall RC 5B PLUS，SLA-1500)。

1.2 方法

1.2.1 气相色谱仪仪器条件

离子火焰检测器,SP-2560石英毛细管柱（75 m×0.18 mm×0.14 μm，Supelco Inc.,Oakville,ON,Canada）。通过20∶1（20∶1 split）进样1 μl的己烷提取液。开始温度55℃维持5 min，之后按15℃/min增加到155℃，并维持56 min；再以10℃/min增加到240℃，最后再维持15 min。氢气作为载体：排出压力16.3 psi，流速为0.3 ml/min；氦气作为尾吹气，流速：10 ml/min。

1.2.2 样品准备

将加单宁（PPC，SF）和未加单宁培养的细菌，分别在37℃、120 r/min振荡培养，每个浓度（紫色达利菊单宁浓度分别为0、10、50 μg/ml；红豆草单宁浓度分别为0、50、200 μg/ml）做了3个重复，浓度的选择是根据单宁的最小抑菌量（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），PPC 为20～40 μg/ml，SF 为 100～150 μg/ml。培养10 h后取出，离心（12 000 r/min，4 ℃）10 min，弃去上清液，用PBS重悬细菌，再同样离心，重复3次洗涤。最后，倾去上清液，冻干成粉末备用。

1.2.3 样品测定

参照Evans[5]的脂肪酸提取方法，准确称取大肠杆菌冻干粉约50 mg到25 ml试管（事先用甲醇洗3遍）中，每个样品称取一个。加入CH3Cl3∶HCH3OH=2∶1 4 ml，振摇，静止过夜。混匀，离心（12 000 r/min、4℃）10 min，移出上清液到另一干净试管。沉淀再加4 ml液体(CH3Cl3∶HCH3OH∶H2O=2∶1∶0.8)，静止2 h，离心（12 000 r/min、4 ℃）10 min。移出并合并两次上清液，总体积为V。加入V/3.8 ml的氯仿和等体积的水。待分层后，取出下层即为脂层，40℃氮气吹干。氮气吹干的样品加入100 μl Nonadecanoic acid(C19∶0)methyl ester作为标准物质。加入2 ml甲醇钠（用甲醇溶解成浓度为0.5 mmol/l），摇匀，充N2，把样品放到50℃水浴中10 min。等温度降下来后加入 1 ml BF3(14%Boron triflouride)，充 N2，把样品放到50℃水浴中10 min；温度降下来之后加入5 ml水和5 ml己烷，混匀。静止10 min，待分层，上层即为测试样品，经0.22 μm滤膜过滤后，上气相色谱仪分析。

1.3 数据分析

脂肪酸数据是通过Agilent工作站B.01.03离线处理系统获得数据，经脂肪酸分析软件进行计算，脂肪酸结果分析是通过SAS 9.0中ANOVA进行。

2 试验结果与分析

在培养大肠杆菌时加入不同浓度的单宁，经10 h作用后，通过气相色谱观察从细菌细胞膜提取的脂肪酸的变化。从表1可以看到，ATCC25922细胞壁脂肪酸由63.49%（＞50%）的饱和脂肪酸（Saturated Fatty Acid，SFA)和36.51%的不饱和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acid，USFA）构成，其中棕榈酸(C16∶0)、棕榈油酸(C16∶1)、C16∶0-2OH 和 C18∶1 c11 是构成 E.coil脂质部分的主要脂肪酸。在加入紫色达利菊单宁后，与对照相比，饱和脂肪酸明显升高，特别是棕榈酸(C16∶0)显著增加，棕榈油酸(C16∶1)和异油酸(C18∶1)显著降低；而随着单宁浓度的增加，仅仅表现了肉豆蔻酸(C14∶0)的显著降低和异油酸(C18∶1)的显著升高；与低浓度相比，肉豆蔻酸(C14∶0)的显著降低，棕榈酸(C16∶0)显著降低，棕榈油酸(C16∶1)和异油酸(C18∶1)显著升高；而加入红豆草单宁后，与对照相比，肉豆蔻酸(C14∶0)和棕榈酸(C16∶0)显著降低，异油酸(C18∶1)显著升高；而随着单宁浓度的增加，表现了肉豆蔻酸(C14∶0)和棕榈油酸(C16∶1)的显著降低，C16∶0-2OH和C18∶1 c11的显著升高；与低浓度相比，棕榈油酸(C16∶1)和C18∶1 c11的显著降低。

成对脂肪酸比例的变化将影响细胞膜的流动性。在加入单宁培养细菌前后，观察单宁对成对脂肪酸的影响，发现低浓度（低于MIC）PPC单宁，使成对脂肪酸比例（饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸）增加，而高浓度时没有明显变化，原因可能是缩合单宁对细菌细胞的聚集作用和H2O2对细胞毒害作用的双重结果。在低浓度时，紫色达利菊单宁对细胞的聚集、对蛋白质和脂质体的聚集作用程度小，而H2O2发挥了毒害作用，将不饱和脂肪酸氧化成饱和脂肪酸，成对脂肪酸比例增加。而对于低浓度（低于MIC）的红豆草单宁，H2O2的产生量小，所以未起到氧化作用；而在高浓度时，主要脂肪酸C16∶0有明显的增加，红豆草单宁的聚集作用要比紫色达利菊单宁弱，因此高浓度时仍然是H2O2对细胞毒害作用占主要地位。从图1、图2、图3、图4中看到，在加入10 μg/ml紫色达利菊单宁时，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA均显著升高（P＜0.01）；而加入50 μg/ml紫色达利菊单宁时，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA与对照相比差异不显著，与低浓度显著降低（P＜0.05）。

表1 经单宁处理的大肠杆菌细胞主要脂肪酸比例的变化

图1 紫色达利菊单宁和红豆草单宁对大肠杆菌细胞脂肪酸C16∶0/C16∶1比例的变化

图2 紫色达利菊单宁和红豆草单宁对大肠杆菌细胞脂肪酸TT16∶0/TT16∶1比例的变化

而在加入50 μg/ml红豆草单宁时，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA的变化与对照差异不显著；而加入200 μg/ml红豆草单宁时，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1变化与对照相比显著升高（P＜0.05），C18∶0/C18∶1、SFA/USFA差异不显著；C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、SFA/USFA比低浓度显著升高（P＜0.05），C18∶0/C18∶1差异不显著。

图3 紫色达利菊单宁和红豆草单宁对大肠杆菌细胞脂肪酸C18∶0/C18∶1比例的变化

图4 紫色达利菊单宁和红豆草单宁对大肠杆菌细胞脂肪酸SFA/USFA比例的变化

3 讨论

对于新型抗生物质来说，脂质合成途径似乎是一个重要的过程[6-8]。由于单宁对细胞质膜似乎成了作用的主要位置，并影响脂肪酸的构成和结构的改变。在对百里香酚、柠檬烯、香芹酚等多酚化合物进行研究时，低于MIC的量会使不饱和脂肪酸含量增加[9]，从而增加膜的流动性[10]；另一研究表明，用这些化合物处理细胞2 h后，不饱和脂肪酸减少，而饱和脂肪酸增加[11]。而本试验的结果是，在加入低于MIC的紫色达利菊单宁时，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例增加，而对于红豆草单宁没有影响；在高于MIC时，红豆草单宁仅表现主要成对脂肪酸的比例增加。总之，说明了多酚类化合物作用于细菌细胞膜的机制可能是干扰膜脂质层，并引起细胞膜结构的变化。

细胞通过多组分膜脱氢酶来产生饱和脂肪酸[12-13]。许多研究也表明，酚类和萜烯类化合物都作用于细胞外膜，增加其通透性[14-16]，可能由于膜物质的流失，脱氢酶分散出来对膜上脂肪酸产生影响。在膜脂质层中饱和脂肪酸含量高会导致膜流动性降低，硬度增加[10]，而不饱和脂肪酸太少，随着细胞的生长和磷脂的合成，不久细胞就会代谢失衡、调亡[17]。如苯、苯胺等可溶于水的亲脂物质在低浓度时都能引起饱和脂肪酸和总磷脂浓度的增加，原因可能是需要一个较高密度的膜，通过饱和脂肪酸体现出来。

4 结论

单宁能够引起细菌细胞壁脂肪酸结构的变化，我们认为这可能是其抑制细菌生长的一个原因，也为阐明单宁的抑菌机理提供一个理论支持。随着多酚化学及结构的不断研究发展,对多酚的利用是必然趋势。植物多酚作为一类可再生的绿色资源，必将成为人类充分利用的重要资源之一。