川芎嗪对PGcABCG-2蛋白影响的研究

川芎嗪对PGcABCG-2蛋白影响的研究

杨栋1，张培彤1*，王耀焓1，郭秀伟1，马雪曼2

(1.中国中医科学院广安门医院肿瘤科,北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029)

摘要：目的研究川芎嗪对肺癌PG-BE1干细胞样细胞ABCG-2蛋白表达的影响。方法采用无血清成球培养法分选PG-BE1中的干细胞样细胞亚群，并检验其干性,采用MTT法检测PG-BE1干细胞样细胞与原代细胞对常用化疗药的耐药性。采用Western blot法检测PG-BE1干细胞样细胞与原代细胞ABCG-2蛋白表达及不同浓度川芎嗪对ABCG-2蛋白表达的影响。结果PG-B1干细胞样细胞的干细胞相关蛋白表达及克隆灶形成数目与原代细胞差异有统计学意义；PG-BE1干细胞样细胞化疗药耐药性强于原代细胞；PG-BE1干细胞样细胞ABCG蛋白表达高于原代细胞；川芎嗪对ABCG蛋白的表达有抑制作用。结论无血清成球培养法可有效富集PG-BE1干细胞样细胞，PG-BE1干细胞较其原代细胞有更强的耐药性，这可能与其高表达ABCG-2蛋白有关,川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞ABCG-2蛋白有抑制作用。

关键词：细胞耐药;肺癌干细胞;ABCG-2;川芎嗪

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.024

中图分类号：R273文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)08-0833-04

基金项目:国家自然科学基金面上项目(81173450)；国家自然科学基金青年项目(81302963)。

作者简介:杨栋(1985-)，男，博士研究生，医师，主要从事肺癌血瘀证研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-03-06)

*通信作者:张培彤，电话-13910678101，电子信箱-zhangpeitong@sohu.com

Study on the effect of TMP on the expression of PGcABCG-2 protein

YANG Dong1,ZHANG Peitong1*,WANG Yaohan1,GUO Xiuwei1,MA Xueman2

(1.Department of Oncology,Guang’anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100053,China;

2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo study on the effect of TMP,which is the effective composition of Chuanxiong,on the expression of ABCG-2 protein of high metastatic human lung cancer(PG-BE1) cells.MethodsFirst of all,we sort the cancer stem cell(CSC) subgroup from the high metastatic human lung cancer cells(PG-BE1) by serum free sphere culture method and examine the properties of stem cells.MTT is used to exam the resistance to common chemotherapy medicine of the PG-BE1 CSC like cells and parental cells. Then we use the western blot experiment to verify the expression of ABCG-2 protein in the PG-BE1 CSC like cells and parental cells and the influence of different concentration of TMP on the expression of ABCG-2 protein.ResultsThe number of clone formation and the expression of CSC related protein show significant differences.PG-BE1 CSC cells have stronger chemotherapy resistance than parental cells.The expression of ABCG-2 protein is higher than parental cells.TMP can inhibit the expression of ABCG-2 protein.ConclusionThe serum free sphere culture method can effective enrich the CSC like cells and the PG-BE1 CSC like cells show stronger chemothrepy resistance than their parental cells.High expression of ABCG-2 protein may contribute to the themotherapy resistance.TMP can inhibit the expression of the ABCG-2 protein of PG-BE1 CSC like cells.

Keywords:chemotherapy resistance;lung cancer stem cells;ABCG-2;Ligustrazine

肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MRD)是肿瘤化疗失败和疗后复发的关键因素，逆转MRD是增强化疗疗效和减少肿瘤复发的关键。关于MRD的产生，学者多从细胞药物外排能力增强、细胞靶标变异、DNA损伤修复能力增强及凋亡逃避等角度解读。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是近年来被发现的肿瘤组织中含量极少但对肿瘤的发生、侵袭、转移等起关键作用的细胞亚群，因CSCs具有高表达ABC转运蛋白、多处于静息期、DNA损伤修复能力强、高表达凋亡抑制基因等生物学特性，使其在细胞耐药方面体现出优势，因而被认为是肿瘤MRD的关键，靶向杀伤CSCs有望有效逆转MRD。

1材料

高转移性人巨细胞肺癌细胞PG-BE1，由中国中医科学院广安门医院肿瘤研究室提供。Human FGF-basic：美国Pepro Tech公司，货号：AF-100-18B;Human EGF：美国Pepro Tech公司，货号：AF-100-15;B27 Supplement(50×):美国Gibco公司，货号：7504-044；MTT：美国Sigma公司，货号：M2128；OCT-4 antibody：美国CST公司，货号：2750;SOX-2 antibody：美国CST公司，货号：3579;Nanog antibody:美国CST公司，货号：4893;β-Actin(13E5) Rabbit mAb:美国CST公司，货号：4970；Anti-BCRP/ABCG2 antibody[BXP-21]:美国abcam公司，货号：ab3380；Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)：美国abcam公司，货号：ab97051;Goat F(ab’)2 polyclonal Secondary Antibody to mouse IgG+IgM+IgA-H&L(HRP):美国abcam公司，货号：ab6006；盐酸川芎嗪：中国药品生物制品鉴定所，批号：110817-200305；顺铂(DDP)注射液：云南个旧生物药业有限公司，批号：H53021740；紫杉醇注射液：北京协和药厂，产品批号：130907；注射用盐酸吉西他滨：江苏豪森药业股份有限公司；产品批号：140105；凝胶成像分析系统：美国BIO-RAD公司；酶标仪：美国BioTek公司，型号：SIAFRT SYNERGYHT。

2方法

2.1细胞培养与干细胞分选常规复苏、培养PG-BE1细胞，待其进入指数生长期,胰酶消化后用PBS反复清洗3遍，重悬于含有1%双抗、20 μg/L FGF、20 μg/L EGF、2% B27及5 μg/mL insulin的DMEM/F12培养基中，调整其浓度为2×104cells/mL，后接种于超低吸附6孔板中，每孔接种2 mL，待细胞成球且细胞球表面颜色变暗，折光度变低时收集细胞用于以下实验。

2.2平板克隆形成实验检测PG-BE1成球细胞与原代细胞克隆形成能力收集PG-BE1原代细胞及成球细胞，消化后重悬于含10% FBS的RPMI 1640培养基中，调整其浓度为200 cells/mL，分别接种于6孔板中，每孔接种2 mL，置于细胞培养箱中培养6 d，后弃去培养液，95%乙醇固定后行结晶紫染色,倒置显微镜下(40倍)观察每孔随机5个视野下超过10个细胞的克隆灶的数目。

2.3Western blot法检测PG-BE1成球细胞与原代细胞OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表达收集PG-BE1原代细胞及成球细胞，提取细胞总蛋白，用BCA法测定各组总蛋白浓度，分别制备浓缩胶与分离胶，加样后分别行蛋白电泳、电转移,5%脱脂奶粉封闭后，一抗(稀释倍数为1∶1 000)、二抗(稀释倍数为1∶2 000)孵育各1 h，后于暗室中滴加超敏发光液孵育5 min，于凝胶成像系统拍照，并用Quantity one软件分析各组蛋白表达量。

2.4MTT法检测PG-BE1原代细胞与干细胞样细胞的化疗药耐药性收集PB-BE1原代细胞及干细胞样细胞，重悬于PBS缓冲液中，调整其浓度为5×104个/mL。上述两种细胞均随机分为顺铂组、吉西他滨组及紫杉醇组(各化疗药均设置高、中、低不同浓度)，各组细胞经药物干预后接种于96孔板中，每孔接种200 μL。培养48 h后向各孔内加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，于细胞培养箱中继续培养4 h。吸出各孔中液体,向各孔加入DMSO 150 μL，于低速震荡板上震荡10 min后，于酶标仪上490 nm处测得各孔吸光值，根据各孔吸光值，计算各组细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%

2.5Western blot法检测PG-BE1原代细胞与干细胞样细胞以及川芎嗪干预后PG-BE1干细胞样细胞ABCG-2蛋白表达分别收集PG-BE1原代细胞、干细胞样细胞(分常氧环境和低氧环境,低氧环境为5%O2、5%CO2、90%N2)以及经高(500 μg/mL)、中(300 μg/mL)、低(100 μg/mL)浓度川芎嗪干预后的PG-BE1干细胞样细胞，按2.3步骤行ABCG-2蛋白含量检测。

2.6统计方法采用专业统计软件SPSS 17.0进行统计，PG-BE1干细胞样细胞与原代细胞的比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析,多组内两组间比较采用LSD检验。

3结果

3.1PG-BE1干细胞样细胞分选接种后第3天，可见有小球体形成，随培养时间延长，球体体积逐渐增大，至第6天时，细胞球球体颜色变暗，折光度降低。

注：图A1为贴壁生长的PG-BE1细胞，图A2-8分别为刚接种及1～6 d的干细胞球形成情况。 图1　倒置显微镜观察PG-BE1干细胞样细胞形成(×200)

3.2PG-BE1干细胞样细胞与原代细胞平板克隆形成实验PG-BE1成球细胞与原代细胞的平板克隆灶形成数目分别为(3.94±1.06)个和(8.06±1.31)个，差异有统计学意义(P<0.001)，镜下可见克隆灶呈散在分布，每个克隆灶由多个细胞组成，呈较规则的圆形。

注:图B1为平板克隆形成实验所用的6孔板，其中，上3孔为PG-BE1细胞，下3孔为PG-BE1 sphere细胞；图B2为倒置显微镜下克隆灶形态(结晶紫染色法，×200) 图2　PG-BE1干细胞样细胞与原代细胞平板克隆形成实验

3.3PG-BE1干细胞样细胞与原代细胞OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表达PG-BE1成球细胞表面的干细胞相关表面标志SOX-2、OCT-4、Nanog的表达均高于原代细胞(见图3)，以原代细胞光密度值作为参照值，成球细胞SOX-2、OCT-4、Nanog的相对光密度值分别为(1.99±0.59)、(1.52±0.21)、(1.44±0.36)，2种细胞比较的P值分别为0.017、0.01、0.004。见图3。

3.4PG-BE1干细胞样细胞与原代细胞化疗耐药比较除48 h低浓度吉西他滨条件下，PG-BE1干细胞样细胞与原代细胞的耐药性(生长抑制率)无区别外(P=0.878)，在24,48，72 h的时间点上，PG-BE1干细胞样细胞对DDP、吉西他滨、紫杉醇的耐药性均强于其原代细胞(P<0.05)。

图3　SOX-2、OCT-4、Nanog蛋白表达

3.5Western blot法检测各组细胞ABCG-2蛋白表达常氧环境下培养的PG-BE1干细胞样细胞的ABCG-2蛋白的表达高于PG-BE1原代细胞(P<0.001);不同浓度的川芎嗪及DDP对ABCG-2蛋白的表达有一定的抑制作用(P<0.05)，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

注:图E1为不同氧浓度下PG-BE1干细胞样细胞及其原代细胞ABCG-2蛋白表达;图E2为不同浓度川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞ABCG-2蛋白表达影响。 图4　不同组别ABCG-2表达

4讨论

肿瘤化疗耐药是制约化疗疗效和疗后复发的关键因素，探索化疗耐药机制及寻找逆转化疗耐药药物是肿瘤学研究的热点。CSCs是具有异质性的肿瘤组织中含量极少的一个细胞亚群，在肿瘤发生、侵袭、转移等过程中起关键作用。近年来的研究表明，CSCs是引起化疗耐药的关键因素[1-2]，本研究中MTT实验结果显示，PG-BE1干细胞样细胞在24，48，72 h对DDP、吉西他滨、紫杉醇的耐受性多强于其原代细胞，说明PG-BE1干细胞样细胞相对于其原代细胞有更强的化疗耐药性，与绝大多数国内外文献所给出的结论一致。

CSCs具有耐药性的原因之一在于高表达ABC转运蛋白，这已在肝癌[3]、卵巢癌[4]、鼻咽癌[5]、前列腺癌[6]、肾癌[7]等绝大多数人类恶性肿瘤中得到证实。ABC转运蛋白利用ATP水解所释放的能量将细胞中的药物、代谢物、核苷酸、肽类、内源性脂质等物质逆浓度梯度泵出胞外。依据ABC转运蛋白能将进入细胞中的Hoechst33342等荧光染料排除出细胞的原理,可以将细胞系中高表达ABC转运蛋白的细胞分选出来，即所谓的SP(side population,SP)细胞。进一步的研究证实，SP细胞多表达干细胞相关标志[8]和具有干细胞生物学特性[9-10]，因而被认为是干细胞样细胞。在本研究中，我们也发现，PG-BE1干细胞样细胞的ABCG-2蛋白的表达明显高于其原代细胞，与上述文献中的结论一致。

川芎嗪是常用活血药川芎的有效成分，具有钙离子通道阻滞活性，被认为有可能通过抑制ATP依赖的转运蛋白的表达而有助于逆转化疗耐药。魏志霞[11]研究发现,川芎嗪对肝癌多药耐药细胞SMMC-7221/ADM的耐药性有一定的逆转作用，其逆转耐药作用可能与其抑制细胞表面多药耐药蛋白P-gp的表达下调，从而减少细胞毒性药物外排有关,类似的研究结论在卵巢癌[12]、乳腺癌[13]、恶性淋巴瘤[14]、胃癌[15]、结肠癌[16]等的研究中亦得到证实。在本研究中，我们发现不同浓度川芎嗪对ABCG-2的表达均有一定的抑制作用，不同浓度之间的抑制作用无差异，川芎嗪对ABC转运蛋白的抑制作用可能会对肿瘤多药耐药产生一定的逆转作用。

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