基于病理学评价淫羊藿女贞子对激素干预哮喘大鼠的影响

基于病理学评价淫羊藿女贞子对激素干预哮喘大鼠的影响

年宏蕾,刘仁慧*,许利平,杨燕,王秀娟*

(首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069)

摘要：目的基于病理学评价研究药对淫羊藿女贞子对激素干预哮喘大鼠的影响。方法卵蛋白致大鼠慢性哮喘模型后，腹腔注射地塞米松模拟激素干预过程，在激素应用同时及撤停时合用中药淫羊藿女贞子，观察对肺组织病理、血及肺泡灌洗液(BALF)涂片嗜酸性粒细胞(EOS)数量的影响。结果激素干预组、淫羊藿女贞子合激素Ⅰ、Ⅱ组显著改善肺组织支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞程度(分别为0.391±0.200，0.429±0.200，0.429±0.200，P均<0.05)，降低BALF中EOS数量(分别为8.30±2.06，9.70±2.45，10.60±2.32，P<0.05或0.01)及肺组织总管壁厚度(分别为106.26±14.00，95.73±14.78，87.47±14.44，P均<0.01)；激素干预组、淫羊藿女贞子合激素干预Ⅰ组显著抑制血EOS数量(分别为5.30±2.31，5.50±1.51，P均<0.01)，改善肺组织EOS浸润(分别为0.420±0.200，0.348±0.200，P均<0.05)；淫羊藿女贞子合激素Ⅰ组可显著降低肺组织平滑肌厚度(16.46±4.17，P<0.05)。结论激素应用同时配伍淫羊藿女贞子可增强协同抗炎作用及抑制哮喘气道重塑的作用。

关键词：糖皮质激素；淫羊藿；女贞子；气道炎症；气道重塑；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.022

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)08-0826-04

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81373814)；北京中医药薪火传承“3+3”工程二室一站建设项目(2012-SZ-C-42)；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目(SIT&TCD201504097)。

作者简介:年宏蕾(1991-)，女，硕士研究生，主要从事中药及复方的药效及作用机制研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-09-04)

*通信作者:刘仁慧，电话-(010)83911639，电子信箱-liurenhui995@163.com

王秀娟，电话-(010)83911624，电子信箱-wxj0517@sina.com

HerbaEpimediiandFructusLigustrilucidion pathology evaluationin

asthmatic rats with hormone intervention

NIAN Honglei,LIU Renhui*,XU Liping,YANG Yan,WANG Xiujuan*

(School of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University;

Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Collateral Disease Theory Research,Beijing 100069,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and glucocorticoids(GC) on the pathology change in the asthmatic rats.MethodsRat asthmatic model was established by sensitization and challenge with ovalbumin(OVA).Dexamethasone was injected into asthmatic rats with the oral gavage of Epimedium and Ligustrumlucidum at different treatment stage of GC withdraw.The pathological changes of lung tissue and the eosinophils (EOS) number in the branchoalveolar lavage fluids(BALF) and blood were observed.ResultsThe GC group and the first and second groups of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC alleviated bronchial mucosa epithelial shedding and lumenobstruction (0.391±0.200,0.429±0.200,0.4290±0.200,P<0.05),reduced the EOS number in BALF (8.30±2.06,9.70±2.45,10.60±2.32,P<0.05 or 0.01),and decreased the total bronchial wall area in the lung tissue (106.26±14.00,95.73±14.78,87.47±14.44,P<0.01).The GC group and the first group of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC reducedthe EOS number inthe blood (5.30±2.31,5.50±1.51,P<0.01) and the EOS infiltration in the lung tissue (0.42±0.200,0.348±0.200,P<0.05).The first group of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC can reduce the smooth musche area in the lung tissue (16.46±4.17,P<0.05).ConclusionsThe combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC hasbetter anti-inflammatory effects on the asthmatic model of rats,and play a protective role in inhibiting airway remodeling.

Keywords:asthma;glucocorticoids;Herba Epimedii;FructusLigustri Lucidi;airway inflammation;airway remodeling;rat

哮喘是全球范围内严重威胁公众健康的一种常见慢性病[1]，目前针对哮喘发病机制中气道炎症学说，糖皮质激素(glucocorticoids,GC)被认为是防治哮喘的首选药物，但能否有效抑制气道重塑尚存在争议[1-2]，且实践中使用GC也存在诸多不良反应[3]。现代学者认为，外源性超生理剂量的GC类同于“壮火”，发越肾气、肾精，致火旺阴伤，日久累及肾阳，最终形成阴阳两亏[4-5]，防治GC的不良反应当以补肾中阴阳为基本立法。课题组前期研究发现，平补肾中阴阳的药对淫羊藿女贞子能够协同激素抗炎，并拮抗激素不良反应[6-8]。本研究通过观察与气道炎症、气道重塑相关的病理学改变，评价药对协同激素治疗哮喘的疗效。

1材料

SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(120±10) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK(京)2007-0001。402A超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；NIS-Elements BR 3.2图像分析软件、尼康(Nikon)ECLIPSE 80i生物显微镜(北京锐驰恒业仪器科技有限公司);莱卡2016型切片机(上海莱卡仪器有限公司)。女贞子、淫羊藿中药材均购自北京同仁堂药店；卵清白蛋白(OVA)、氢氧化铝凝胶(美国Sigma公司)；地塞米松磷酸钠注射液(天津药业焦作有限公司，批号10081711)。

2方法

2.1动物分组筛选合格动物60只，按照随机数字表法分为6组，即正常对照组(1组)、哮喘模型组(2组)、激素干预组(3组)，淫羊藿女贞子组(4组)，淫羊藿女贞子合激素干预Ⅰ组(5组)、合激素干预Ⅱ组(6组)，每组10只。

参考文献2.2造模及给药方法[9]于实验1～35 d，除正常对照组外，其余动物全部造模。在普通哮喘模型制备成功的基础上，各造模组均每周2次给予1%OVA雾化吸入直至结束。实验36～49 d(激素撤停前阶段)，3、5、6组腹腔注射地塞米松注射液0.5 mg/kg，1次/d；实验50～77 d(激素撤停中阶段)，每周递减腹腔注射地塞米松0.1 mg/kg。4组在哮喘模型处理的基础上，于实验36 d分别开始灌胃淫羊藿女贞子水溶液(9.5 g/kg)；5、6组在相应GC组处理的基础上,分别于实验36、50 d开始给予淫羊藿女贞子水溶液(9.5 g/kg)。

2.3标本采集与检测78 d处死动物，尾部取血作血涂片；开胸，取肺组织连同气管，结扎左主支气管，剪取左肺；右肺行支气管肺泡灌洗术，回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，分离BALF沉淀涂片。血及BALF涂片作瑞氏染色，记录嗜酸性粒细胞(eosinophils，EOS)数目。左肺行肺组织HE染色，行气道炎症半定量分析[10];计算支气管基底膜周径(Pbm)、标准化气道总管壁厚度(Wat)及标准化平滑肌厚度(Wam)[11],基于各组动物之间Pbm差异显著(P<0.01)，采取Pbm、Wat及Wam值除以相应动物体质量(kg)为最终标准化值，评价对气道重塑的影响作用。

3结果

3.1各组大鼠血及BALF涂片EOS计数的比较见表1。

表1　各组大鼠血及BALF涂片EOS计数的比较

注：与1组比较，##P<0.01；与2组比较，△P<0.05，△△P<0.01

3.2各组大鼠肺组织病理学半定量统计结果见表2～5，图1。2组支气管黏膜上皮水肿、增生程度，支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞程度，支气管壁炎性细胞浸润程度,EOS增多程度较1组差异有统计学意义。与2组比较，3、5、6组支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞程度有显著改善；3、5组能抑制肺组织EOS浸润。

表2　各组大鼠支气管黏膜上皮水肿、增生程度的比较 ± s, n=8)

表3　各组大鼠支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞程度的比较 ± s, n=8)

表4　各组大鼠支气管壁炎性细胞浸润程度的比较 ± s, n=8)

表5　各组大鼠EOS浸润程度的比较

注：1)与1组比较，#P<0.05；与2组比较，△P<0.05。2)半定量采用Ridit分析法，以合计数为标准组计算。3)平均级数计算是将各分级分别计分为0、1、2、3，计算平均分。

图1　支气管肺组织HE染色照片(×200)

3.3各组大鼠支气管壁总厚度和平滑肌厚度的比较见表6。各组之间Pbm值无显著差异。与1组比较，2组Wat值、Wam值均显著增高(P<0.05或0.01)；与2组比较，3、5、6组可显著降低Wat值(P<0.01)；5组可显著降低Wam值(P<0.05)；与3组比较，各给药组均可显著降低Wam值(P<0.05或0.01)。

组 别Pbm(μm/kg)Wat/〔μm2/(μm·kg)〕Wam/〔μm2/(μm·kg)〕1组2617±245117.24±13.41 15.53±2.29 2组2810±244141.61±26.21# 22.02±6.14## 3组2535±253106.26±14.00△△24.75±3.18 4组2778±206144.12±27.23 20.29±4.62 5组2580±38995.73±14.78△△16.46±4.17△▲▲6组2567±45387.47±14.44△△19.07±4.97▲

注：与1组比较，#P<0.05，##P<0.01；与2组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与3组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4讨论

慢性气道炎症是哮喘产生的病理基础,以气道内大量EOS浸润为主；气道重塑是哮喘发生和发展的重要环节，是慢性炎症反复损伤和修复的结果，导致不可逆性气流阻塞和增加气流阻力，同时还加重气道高反应性[12-13]，是顽固性哮喘的主要原因之一[14]。哮喘的评价标准以组织学病理改变为主，基本的病理改变包括慢性剥脱性嗜酸细胞性支气管炎及气道重建[15]。本实验结果表明，哮喘大鼠肺组织中支气管黏膜上皮水肿、增生，支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞，伴炎性细胞浸润，且支气管壁Wat值、Wam值均显著增高，血及BALF中EOS数量升高，提示哮喘大鼠存在以EOS增高为主要特征的气道炎症改变及气管壁、平滑肌增厚为评价指标的气道重塑。经药物治疗后，激素组对肺组织支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞程度有显著改善，并显著降低血及BALF中EOS数量;淫羊藿女贞子合激素Ⅰ组显著缓解肺组织支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞程度，降低血及BALF中EOS,并可显著降低Wat值及Wam值；淫羊藿女贞子合激素Ⅱ组对肺组织支气管黏膜上皮脱落、管腔阻塞程度有改善，并降低BALF中EOS数量及支气管壁Wat值。提示地塞米松对哮喘气道炎症有明显的改善作用，但对气道重塑没有明显的作用；淫羊藿女贞子协同激素共用，对哮喘的气道炎症及气道重塑均有显著改善作用,且淫羊藿女贞子合激素干预Ⅰ组抑制Wam的作用更优，提示中药淫羊藿女贞子在激素应用早期介入，不仅可协同激素抗炎，并可抑制哮喘的气道重塑的病理改变。

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