四逆散及其拆方对实验性溃疡性结肠炎大鼠SOCS1·STAT6活性的影响

四逆散及其拆方对实验性溃疡性结肠炎大鼠SOCS1·STAT6活性的影响

赵令竹,曲道炜,林庶茹,卢健*,张宏邈

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

摘要：目的从IL-4/STAT6信号通路入手，以该通路负反馈调节因子SOCS1和关键因子STAT6为检测指标，多角度探查溃疡性结肠炎的发生与IL-4的关系。方法将实验动物分为6组,采用免疫法造模，用免疫组化法检测大鼠SOCS1、STAT6的活性。结果模型组实验大鼠SOCS1活性(0.485 5±0.178 0)显著低于正常组(0.655 2±0.187 4)，P<0.05；而STAT6 活性(0.803 0±0.208 2)则明显高于正常组(0.589 3±0.191 9)，P<0.05。四逆散能显著增加实验大鼠SOCS1活性(0.576 5±0.208 0)(P<0.05),降低STAT6活性(0.579 8±0.152 6)(P<0.05)；柴芍配伍(0.562 5±0.275 7)对SOCS1活性的影响与四逆散(0.576 5±0.208 0)比较差异无统计学意义，对STAT6活性(0.529 4±0.144 3)表达的影响显著优于四逆散(0.579 8±0.152 6)(P<0.05);芍枳甘配伍(0.616 9±0.200 6)对STAT6活性的影响作用明显,与四逆散(0.579 8±0.152 6)比较差异无统计学意义；柴枳甘配伍对SOCS1(0.509 1±0.227 9)、STAT6(0.756 1±0.263 6)的影响与模型组(0.485 5±0.178 0；0.803 0±0.208 2)比较差异无统计学意义。结论四逆散能够通过刺激SOCS1活性,抑制STAT6活性表达来调节IL-4/STAT6通路，进而干预实验性溃疡性结肠炎。其中，柴芍配伍作用明显;芍枳甘配伍对STAT6活性的影响作用明显，但对SOCS1的影响不显著；柴枳甘配伍对SOCS1、STAT6的影响均不显著。

关键词：四逆散；SOCS1；STAT6；溃疡性结肠炎；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.026

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)10-1056-04

基金项目:教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题(20122133120009)。

作者简介:赵令竹(1975-)，女，博士研究生，讲师，主要从事《伤寒论》经典方剂的现代研究与应用。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2015-01-06)

*通信作者:卢健,电话-15242007553,电子信箱-juioo@sina.com

Sini powders and different compatibilities influence on SOCS1·STAT6 in

experimental ulcerative colitis rats

ZHAO Lingzhu,QU Daowei,LIN Shuru,LU Jian*,ZHANG Hongmiao

(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relation with IL-4 and UC through multi angles,starting with the IL-4/STAT6 pathway.MethodsThe experimental animals were divided into 6 groups.We made the model in immune method,detected activity of SOCS1 and STAT6 in rats with immune.ResultsThe activity SOCS1 in model group of rats (0.485 5±0.178 0) were significantly lower than that of normal group (0.655 2±0.187 4)(P<0.05),but the activity of STAT6(0.803 0±0.208 2) were significantly higher than that in the normal group (0.589 3±0.191 9) (P<0.05).Sinisan Powders can significantly increase the activity of SOCS1 (0.576 5±0.208 0) in experimental rats (P<0.05),decrease STAT6 activity (0.579 8±0.152 6) (P<0.05).The effects of Chaishao compatibility (0.562 5±0.275 7) was no significant difference with SOCS1 and Sinisan (0.576 5±0.208 0) Powders (P>0.05),the activity of STAT6 (0.529 4±0.144 3) was significantly better than the Sinisan (0.579 8±0.152 6) Powders (P<0.05).Shaozhigan compatibility effects on activity of STAT6 (0.616 9±0.200 6) significantly.Chaizhigan compatibility had no significant difference with SOCS1 (0.509 1±0.227 9),STAT6(0.756 1±0.263 6) and the model group (0.485 5±0.178 0;0.803 0±0.208 2) in effects (P>0.05).ConclusionSinisan Powders can regulate expression of the IL-4/STAT6 pathway by stimulating the activity of SOCS1,inhibiting the activity of STAT6,then intervention experiment UC.And the effect of Chaishao compatibility was the best obvious;the effects of Shaozhigan compatibility was obvious on activity of STAT6,but not on SOCS1.The effect of Chaizhigan compatibility were not obvious on SOCS1 and STAT6.

Keywords:Sini powers;SOCS1;STAT6;ulcerative colitis;rat

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)为临床常见病、难治病。大量临床研究与实验研究表明，溃疡性结肠炎的发病与细胞因子密切相关。有研究表明，IL-4作为抗炎因子,参与了溃疡性结肠炎的炎症过程。本课题组成员，在前期工作中已通过实验证实溃疡性结肠炎大鼠的炎症反应与IL-4相关，其可以通过NF-κB相关通路加以调控[1-2]。为进一步探讨溃疡性结肠炎与IL-4的关系，本研究从IL-4/STAT6信号通路入手，以该通路负反馈调节因子SOCS1和关键因子STAT6为检测指标,多角度探查溃疡性结肠炎的发生与IL-4的关系，为研究中药多途径发挥作用提供思路。

1实验材料

四逆散由柴胡、芍药、枳实、甘草以1∶1∶1∶1比例组成。柴胡免煎颗粒(1312079)、芍药免煎颗粒(1312028)、枳实免煎颗粒(1312168)、甘草免煎颗粒(1312100)均购自江苏省江阴天江药业有限公司；固肠止泻丸购自沈阳市东北大药房，批号：132440，由西安阿房宫药业有限公司提供。上述药物按临床成人用量的6.3倍折算实验大鼠的用量。SD大鼠(SPF级，SCXK(辽)2010-0001)60只,雌雄各半，体质量160～180 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。根据前期实验结果，将实验大鼠按体质量随机分为6组，分别为:正常组、模型组、四逆散组、柴枳甘组、芍枳甘组、柴芍组。每组10只，各组体质量统计学比较无显著差异。抗体(BA1110)、DAB显色试剂盒(AR1322),均购自武汉博士德生物工程有限公司。ASP300脱水机，德国徕卡仪器有限公司；SAKURA包埋机，日本樱花会社;Leica(H11210)烤片机，德国徕卡仪器有限公司；DH-GZX电热恒温干燥箱，中国厦门医疗电子仪器厂；湿盒(ZLI-9322),北京中杉金桥生物技术有限公司；OLYMPUS显微镜(BX-51)，TKO光学仪器株式会社(日本)。

2实验方法

2.1免疫法造模[3]应用新鲜家兔结肠黏膜配制抗原乳化液,按1 mL/100 g体质量的浓度分别配制灌胃药物。于造模第1天分别于实验大鼠双侧足跖、腹股沟及背部注射抗原乳化液约0.5 mL/只；第7、14、21天依同法注射；造模第2天开始分组灌胃。每天观察大鼠状态及饮食、饮水情况；每周测1次体质量。实验第24天灌胃后2 h，称重，麻醉，腹主动脉取血；然后全部处死，自肛门2 cm上约8 cm处剖取结肠，剖开、展平结肠，观察黏膜，并以多聚甲醛固定，做病理切片，镜下观察。

2.2结肠组织病理切片常规HE染色，光镜下观察。

2.3大鼠结肠黏膜SOCS1、STAT6免疫组化的测定采用免疫组化法(SP)，按常规步骤进行。SOCS1、STAT6阳性细胞染色均定位于细胞质，以胞质中呈棕黄或更深的棕褐色的细小颗粒为阳性细胞。应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件对实验结果进行分析，以平均光密度反应SOCS1、STAT6细胞活性。

3实验结果

3.1对实验性溃疡性结肠炎大鼠一般状况的影响造模第l4天，实验大鼠出现食量减少、拱背、聚堆、懒动现象。造模第22天，模型组大鼠均出现饮食明显减少，稀便、毛发不泽，拱背、聚堆、懒动，各药物组大鼠上述症状有不同程度改善。

3.2结肠组织病理学模型组大鼠病变结肠黏膜表面可见溃疡，个别深达肌层，炎症反应较重，有充血、糜烂，中性粒细胞浸润，黏膜上皮部分缺失，局部固有层腺体减少，黏膜下层血管增生，黏膜肌层不明显(图1)。其余各组均有不同程度的病变。

图1　实验大鼠结肠组织病理切片(Colon HE×100)

3.3对实验大鼠SOCS1、STAT6蛋白活性的影响

3.3.1对实验性溃疡性结肠炎大鼠SOCS1蛋白活性的影响(图2)与正常组比较,模型组及各给药组实验大鼠SOCS1活性明显降低(P<0.05)；与模型组比较，四逆散组和柴芍组各实验大鼠SOCS1活性均明显升高(P<0.05)；与四逆散组比较，柴芍组无显著性差异(P>0.05)，柴枳甘组与芍枳甘组实验大鼠SOCS1活性明显均显著降低(P<0.05)。见表1。

图2　实验大鼠结肠组织SOCS1免疫组化图片(Colon HE×40)

3.3.2对实验性溃疡性结肠炎大鼠STAT6蛋白活性的影响(图3)与正常组比较，模型组实验大鼠STAT6活性明显增高(P<0.05)；与模型组比较，四逆散组、芍枳甘组与柴芍组实验大鼠STAT6活性显著降低(P<0.05)；与四逆散组比较，芍枳甘组实验大鼠STAT6活性无显著性差异(P>0.05)，柴枳甘组明显增高(P<0.05),而柴芍组则显著降低(P<0.05)。见表1。

图3　实验大鼠结肠组织STAT6免疫组化图片(Colon HE×40)

组 别结肠组织SOCS1平均光密度结肠组织STAT6平均光密度正常组 0.6552±0.1874 0.5893±0.1919 模型组 0.4855±0.1780# 0.8030±0.2082# 四逆散组0.5765±0.2080#△0.5798±0.1526△ 柴枳甘组0.5091±0.2279#▲0.7561±0.2636#▲ 芍枳甘组0.4824±0.1387#▲0.6169±0.2006△ 柴芍组 0.5625±0.2757#△0.5294±0.1443#△▲

注：与正常组比较,#P<0.05；与模型组比较,△P<0.05；与四逆散组比较,▲P<0.05

4讨论

溃疡性结肠炎是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症，中医认为溃疡性结肠炎总属本虚标实之证，本虚以脾肾亏虚，阴阳气血亏虚为主，标实以湿热毒邪蕴结，气血阻滞，兼有肝郁，肺气失宣等[4],辨证治疗溃疡性结肠炎具有明显的优势及鲜明的特色[5]，如以柴胡芍药汤为主方辨证治疗溃疡性结肠炎，疗效显著[6]。中医中药通过何种途径、如何发挥疗效也成为晚近研究的热点。

大量研究表明[7-10],溃疡性结肠炎的炎症反应与IL-4密切相关。IL-4主要通过信号转导子和转录激活子(signal transducers and activator of transcription,STAT)信号转导以及表达细胞信号抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)对Th细胞的分化进行调节。

IL-4的信号转导主要与JAK/STAT途径有关。JAK-STAT细胞信号传递途径是近几年新发现的从分子水平调控细胞因子生物学功能的重要途径之一。一种细胞因子的信号通路可以激活多个JAK激酶，但对激活的STAT分子却具有一定的选择性，IL-4能选择性地激活STAT6,促炎反应的发生可能是IL-4/STAT6信号转导失调所致[11]。IL-4通过SOCSI蛋白调节细胞因子信号的产生和衰减[12]。IL-4/STAT6的信号可使Th2表达SOCS1，而SOCS1的过表达则主要抑制IL-4所诱导的STAT6[13]。SOCS是细胞因子激活的JAK/STAT信号通路必需的负调节因子，对于启动炎症反应非常重要[14]。STAT是最能代表JAK底物的底物之一[15]，在信号转导和转录激活上发挥关键性作用。STAT6作为转录因子调节IL-4的反应[16]，在炎症、自身免疫和变态反应性疾病中起重要作用,近年的研究发现，溃疡性结肠炎大鼠结肠组织STAT6水平升高[17]。

由表1可以看出，模型组实验大鼠SOCS1 活性显著低于正常组(P<0.05),而STAT6活性则明显高于正常组(P<0.05)。灌服四逆散后，实验大鼠SOCS1活性显著增加(P<0.05)，而STAT6活性则显著降低(P<0.05)，说明四逆散能够通过刺激SOCS1活性,抑制STAT6活性表达来调节IL-4/STAT6通路，进而干预实验性溃疡性结肠炎。

从3个拆方组可以看出，柴芍配伍对SOCS1活性的影响与四逆散无显著性差异(P>0.05)，但对STAT6活性表达的影响显著优于四逆散(P<0.05)；芍枳甘配伍对STAT6活性的影响作用明显，与四逆散比较无显著性差异(P>0.05)，但对SOCS1的影响不明显；柴枳甘配伍对SOCS1、STAT6的影响均不显著，与模型组无显著性差异(P>0.05)。

综上分析，四逆散能够通过调节SOCS1、STAT6 活性的表达来影响IL-4/STAT6通路，干预实验性溃疡性结肠炎。方中柴芍配伍作用明显；四逆散去除柴胡后,对STAT6活性的影响作用明显；而四逆散去除白芍后，对SOCS1、STAT6的影响均不明显。

参考文献：

[1]卢健,于彩娜,马骥,等.四逆散对实验性溃疡性结肠炎大鼠IL-4的影响[J].中华中医药学刊,2011,2(4):813-814.

[2]卢健,范颖,马骥,等.四逆散及不同配伍干预溃疡性结肠炎的研究[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(16):109-112.

[3]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2002:1335.

[4]余勰,王晓素.溃疡性结肠炎的中医病因病机研究[J].河南中医,2013,33(7):1020-1021.

[5]王新月,王建云.溃疡性结肠炎中医药治疗的关键问题与优势对策[J].中华中医药杂志,2012,27(2):263-267.

[6]孙显军,王君红.柴胡芍药汤加减治疗溃疡性结肠炎68例疗效观察[J].河北医学,2013,34(2):308-310.

[7]闫曙光.乌梅丸及其拆方对溃疡性结肠炎大鼠细胞因子、炎性介质及TLR4/NF-κB信号通路影响的实验研究[D].成都:成都中医药大学,2012.

[8]王佳林.乌梅丸治疗溃疡性结肠炎的疗效观察及对血清IL-4和IL-8水平的影响[J].海南医学院学报,2014,20(1):80-82.

[9]王秀珍,毛颖,张喆,等.四神丸对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-2,IL-4,IL-8影响的实验研究[J].中医药学报,2013(3):105-107.

[10]何斌,邱洪清,程志健,等.溃疡性结肠炎患者外周血单核细胞中Toll样受体4,NF-κB的表达及其临床意义[J].临床消化病杂志,2013,25(2):76-78.

[11]殷胜骏.乌梅丸加减对溃疡性结肠炎大鼠IL-4/STAT6信号通路的调节作用[D].北京:北京中医药大学,2009.

[12]YU C R,MAHDI R M,EBONG S,et al.Cell proliferation and STAT6 pathways are negatively regulated in T cells by STAT1 and suppressors of cytokin e signaling[J].Journal of Immunology,2004,173(2):737-746.

[13]DICKENSHEETS H L,VNKATARAMAN C,SCHINDLER U,et al.Interferons inhibit activation of STAT6 by interleukin 4 in human monocytes by inducing SOCS-1 gene expression[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96(19):10800-10805.

[14]DALPKE A,HEEG K,BARTZ H,et al.Regulation of innate immunity by suppressor of cytokine signaling (SOCS) proteins[J].Immunobiology,2008,213(3/4):225-235.

[15]李清刚.细胞因子受体介导的信号传递JAK-STAT研究新进展[J].国外医学免疫学分册,2000,23(1):26-27.

[16]张丽,赵德会,桑力轩,等.益生菌VSL#3治疗大鼠溃疡性结肠炎的疗效观察及对STAT6、STAT4的影响[J].胃肠病学与肝病学杂志,2014,23(9):1027-1031,1034.

[17]张夏毅,沈霖,范恒,等.STAT6 mRNA与NF-κB在实验性结肠炎大鼠中的表达[J].国际消化病杂志,2010,30(5):311-313.