原花青素对饲料镉胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏健康状况有关指标的影响

■ 赵盼月 卢俊姣 翟少伟，2

（1.集美大学水产学院，福建厦门 361021；2.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建厦门 361021）

近年来，水产动物饲料中重金属的问题日趋严重。水产饲料中重金属镉（Cadmium,Cd）超标，可对水产动物的多种组织器官和生理功能等产生一系列的毒害作用。肝胰脏是重金属镉产生毒害作用的主要靶器官之一[1-2]，饲料中的镉超标可使水产动物肝细胞空泡化，部分细胞器死亡、解体，溶酶体减少[3]，线粒体损伤，诱导活性氧产生[4]，显著影响肝胰脏转氨酶、过氧化氢酶等的活性[5]。研究表明，通过在饲料中添加植物类黄酮可改善动物的肝胰脏功能[6-8]。原花青素（Oligomeric Proanthocyanidins，OPC）作为植物类黄酮添加在水产动物饲料中的报道日益增多，其可增强水产动物的肝胰脏抗氧化能力[9]，有效清除体内多种自由基[10]，降低血液转氨酶活性[11]。然而在应激胁迫下，OPC是否仍对鱼类肝胰脏健康状况产生有益的作用还鲜见报道。因此，本试验拟以吉富罗非 鱼 （Genetic Improvement of Farmed Tilapia，GIFT）为试验动物，利用本课题组建立的饲料添加CdCl2诱导鱼体产生氧化应激的动物模型[12]，研究OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼血清转氨酶活性、肝胰脏自由基产生以及金属硫蛋白水平等方面的影响，为OPC作为肝胰脏健康促进剂在鱼类养殖中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验动物为吉富罗非鱼，购于福建省漳州市水产开发中心。将240尾平均体重为（8.14±0.05）g的罗非鱼随机分为4个处理组：对照组、Cd组、Cd+OPC组Ⅰ和Cd+OPC组Ⅱ。对照组饲喂基础饲料，其它组饲喂在基础饲料的基础上分别添加100 mg/kg Cd、100 mg/kg Cd+400 mg/kg OPC和100 mg/kg Cd+800 mg/kg OPC的试验饲料。每个处理组4个重复，每个重复15尾鱼。试验期49 d。

1.2 试验饲料与饲养管理

吉富罗非鱼基础饲料的饲料配方见表1。基础饲料中Cd本底值为0.19 mg/kg（绝干重）。基础饲料中添加CdCl2（晶体CdCl2溶于水后与原料充分搅拌混匀），Cd水平为100 mg/kg（实测值为100.12 mg/kg）。试验用OPC（购于南京泽朗医药科技有限公司，含量为98%）为粉末状，将其与原料充分混匀。饲料原料粉碎过40目筛，原料混合均匀，挤压成直径2.5 mm的颗粒，自然风干后，置于自封袋中，-20℃冷藏保存。

表1 基础饲料组成及营养水平（%）

试验鱼饲养于120 cm×60 cm×70 cm循环系统的水族箱中，水体积约为100 L，24 h持续充气。投饵量为鱼体重的3.0%～5.0%，日饱食投喂3次（8:00、13:00和18:00）。投喂30 min后吸取残饵和粪便，日换水量1/3～1/2。试验用水为曝气自来水，光照为自然光源。每天监测水质状况，试验期间水温22～28℃，pH值（7.5±0.3），溶氧浓度＞7.0 mg/l，氨氮浓度＜0.2 mg/l。

1.3 样品采集与组织匀浆的制备

试验结束后，禁食24 h，每缸随机选择6尾试验鱼，采用丁香酚母液麻醉后尾静脉采血，采集后立即离心（3 000 r/min离心10 min），血清于-80℃冰箱保存。采血后的试验鱼解剖，分离出肝胰脏，液氮速冻，-80℃冻存。保存的肝胰脏组织于冰上解冻，取1～3 g组织冰冻生理盐水漂洗，滤纸拭干，称重，放入匀浆玻璃管中，按1 g样品∶9 ml生理盐水加入0.86%的冰冻生理盐水，用玻璃匀浆机匀浆3～5次（匀浆时间10 s/次，间隙30 s）。将制备好的10%组织匀浆在4℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液分装到1.5 ml离心管中，-80℃冻存待用。

1.4 测定指标

血清谷草转氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminease，GOT）和谷丙转氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，GPT）活性均采用赖氏法测定；活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平、抗超氧阴离子自由基能力活性（Anti-free radical superoxide anion，ASA）、抑制羟自由基能力活性（Anti-free radical hydroxyl ability，AHA）、过氧化氢（H2O2）水平、一氧化氮（NO）水平、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平和肝胰脏金属硫蛋白（Metallothionein,MT）水平分别采用化学荧光法、比色法、芬顿法、钼酸法、硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法和酶联免疫吸附法测定。所有试剂盒均由南京建成生物工程技术研究所提供，具体操作方法及步骤见说明书。

1.5 数据统计与分析

试验数据均以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示，用SPSS 17.0分析软件进行单因素方差分析（oneway ANOVA），若存在显著的差异，则采用Duncan's法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼血清转氨酶活性的影响（见图1、图2）

图1 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼血清谷草转氨酶活性的影响

图2 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼血清谷丙转氨酶活性的影响

由图1、图2可以看出，Cd组吉富罗非鱼血清谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）活性均显著高于对照组（P＜0.05），Cd+OPC组与对照组相比均无显著差异（P＞0.05），但均显著低于Cd组（P＜0.05）。

2.2 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏自由基产生的影响（见表2）

表2 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏自由基产生有关指标的影响

从表2可以看出，Cd组吉富罗非鱼肝胰脏ASA和AHA水平显著低于对照组（P＜0.05），Cd+OPC组与对照组相比均无显著差异（P＞0.05），但均显著高于Cd组（P＜0.05）。Cd组MDA、NO、H2O2和ROS水平显著高于对照组（P＜0.05），Cd+OPC组与对照组相比均无显著差异（P＞0.05），但均显著低于Cd组（P＜0.05）。

2.3 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏金属硫蛋白水平的影响（见图3）

图3 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏金属硫蛋白水平的影响

从图3可以看出，Cd组吉富罗非鱼肝胰脏金属硫蛋白水平显著低于对照组（P＜0.05），Cd+OPC组与对照组相比均无显著差异（P＞0.05），但均显著高于Cd组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼血清转氨酶活性的影响

血清转氨酶（GOT和GPT）是反映肝功能的主要敏感指标之一，当鱼类肝细胞受损或通透性增高时，大量的GPT和GOT释放到血液中，导致肝中的转氨酶活性下降，而血清中转氨酶活性升高，不利于机体生长，易引发疾病[13-14]。本试验中，Cd胁迫组吉富罗非鱼血清GOT和GPT活性升高，表明饲料Cd对吉富罗非鱼肝胰脏造成损伤；当饲料中添加OPC后，GOT和GPT活性降低，并达到与对照组无显著差异的水平，表明肝胰脏损伤已得到缓解。苏叶萍等（2010）研究表明，添加500 mg/kg的OPC可降低CCl4胁迫下小鼠血清中GOT、GPT的活性[15]，与本试验的研究结果类似；李华文等（2005）也有报道，适量浓度的OPC可对应激状态下的动物的肝胰脏起到保护作用[16]。这可能与OPC对应激状态下的动物减轻肝胰脏的氧化损伤有关。

3.2 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏自由基产生的影响

当细胞内产生的ROS包括O2-·、H2O2、·OH等自由基水平高于细胞的抗氧化系统防御能力，ROS不能被有效清除时，就会诱发氧化应激[17]。ASA和AHA能间接反映出O2-·和·OH的含量，ASA和AHA降低时，O2-·和·OH含量升高[18]。其中·OH是具有最高反应活性和毒性的氧自由基，对机体危害极大[15]。H2O2是由机体内清除氧自由基的超氧化物歧化酶（SOD）直接捕获O2-·并与之发生歧化反应生成的氧化性较小的物质[19]，能够被体内的谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）消除。NO可与某些自由基结合形成毒性更强的自由基复合物[20]。

肝胰脏在鱼体内占据重要的地位，承担排泄、代谢、解毒和营养吸收等重要的生理功能，在正常状态下，肝胰脏内自由基处于一种不断产生与清除的动态平衡状态。本试验中，在饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏产生的ROS、·OH、H2O2、NO和MDA水平升高。表明在Cd胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏抗氧化系统平衡已被打破，自由基清除系统的功能未及时代偿性增强，过量的氧自由基与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，产生明显的氧化应激。贾景涛等（2012）在饲料中添加200 mg/kg的镉可显著提高罗非鱼肝胰脏MDA的含量[21]。金成官（2008）在鲫鱼饲料中添加CdCl4使得肝脏MDA含量升高[22]。这些研究结果与本试验类似。饲料Cd胁迫下OPC添加组，吉富罗非鱼肝胰脏自由基水平降低，这是由于OPC可直接清除ROS，也可同时通过提高抗氧化酶活性和非酶系物质含量消除ROS的途径降低肝胰脏ROS含量。OPC分子中具有多电子的羟基部分，8个酚羟基（儿茶素）均与双键共轭，为氢原子的供体，且芳环上的共轭双键使电子在分子中得到稳定，2个脂肪族羟基提供良好水溶性。正是这些分子结构特点，使其具有较强的抗氧化活性。研究表明，OPC可以通过抑制过量的H2O2的产生，并清除产生的H2O2来缓解GSH的抗氧化负担，提高应激状态下动物组织中的GSH含量[23-24]；还可以直接清除O2-·减轻SOD负担，提高OPC添加组SOD和GSH-Px活性；OPC进入机体后会被氧化释放大量H+，它可与多种活性氧白由基竞争性结合，保护脂质免于氧化，阻断自由基链式反应，从而使MDA含量降低。此外，OPC具有很强的金属离子螯合作用，能结合并降低活性氧自由基产生所必需的铁离子水平，提高机体ASA水平；它的二羟酚基充分与金属离子（Fe3+、Cu2+、Al3+）及蛋白结合，降低金属离子的活性，抑制催化反应，减少·OH的产生，提高机体AHA水平[25]。

3.3 OPC对饲料Cd胁迫下吉富罗非鱼肝胰脏金属硫蛋白水平的影响

MT是一类广泛存在于生物体内的富含半胱氨酸和巯基、低分子量、能被重金属诱导并能螯合大量的金属离子的结合蛋白。金属硫蛋白可与Cd和Pb等重金属紧密结合，在细胞内起到解毒重金属的作用，减轻重金属对组织器官的各种损伤[26-27]。研究表明，镉在肝胰脏内可诱导产生大量参与重金属解毒的MT，但是当Cd浓度过高，金属硫蛋白水平则呈下降趋势[28-29]。本试验中，Cd组肝胰脏中的金属硫蛋白水平显著低于对照组和Cd+OPC组，表明罗非鱼肝胰脏内Cd浓度大大超过金属硫蛋白的结合能力。OPC组吉富罗非鱼肝胰脏金属硫蛋白含量升高，并达到与对照组接近的水平，这与OPC作为强有力的金属螯合剂，可结合大量的Cd2+，抑制Cd2+对Zn的取代和与Cd2+巯基的结合有关。Zhang J等（2004）报道，OPC可与Pb2+结合形成稳定物质[30]。王静（2013）的研究也表明，OPC可以通过螯合游离的Cd2+，以迅速降低镉毒性而起到保护作用[31]。本试验中，OPC可能与Cd2+结合，进而恢复并提高MT浓度，减轻Cd对肝胰脏的损害。

可见，添加OPC可降低饲料镉胁迫下吉富罗非鱼血清转氨酶活性和肝胰脏自由基水平，提高金属硫蛋白水平，从而改善肝胰脏的健康状况，缓解氧化损伤。本试验中，400 mg/kg添加组即可显著缓解Cd对肝胰脏功能有关指标的影响，而800 mg/kg添加组的缓解效果并没有明显进一步增强。

4 结论

本试验中，在100 mg/kg饲料Cd胁迫下，吉富罗非鱼饲料中添加400 mg/kg的OPC即可降低血清转氨酶活性，减少肝胰脏自由基产生，提高肝胰脏金属硫蛋白水平，改善吉富罗非鱼肝胰脏健康状况。