芪蚣抗纤方及拆方干预大鼠免疫损伤性肝纤维化的实验研究

芪蚣抗纤方及拆方干预大鼠免疫损伤性肝纤维化的实验研究

梁振钰，陈桂敏

(海南医学院，海南 海口 571101)

摘要：目的观察芪蚣抗纤方(QF)及拆方对大鼠免疫损伤性肝纤维化的影响。方法50只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、QF全方干预组、软坚散结药干预组、活血药干预组，猪血清攻击法诱导免疫损伤性肝纤维化大鼠模型，实验过程8周。免疫组化法检测肝组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)相关表达；免疫组织化学染色检测肝纤维化大鼠TGF-β1和Smad2、Smad3阳性表达。结果药物干预后，治疗组TGF-β1含量明显下降，Smad2、Smad3表达减少，全方比拆方效果明显。结论芪蚣抗纤方及拆方对TGF-βl和Smads家族蛋白有显著调节作用，可干预大鼠肝纤维化形成，全方比拆方效果更明显。预防和治疗肝纤维化除了运用常法活血药与软坚药，益气健脾必不可少。

关键词：芪蚣抗纤方；拆方；肝纤维化；转化生长因子-β1(TGF-β1)；Smad2；Smad3

中图分类号：R 9-33

作者简介：尚培中(1964-)，男，河南商丘人，医学硕士，主任医师，主要研究方向：普通外科。

基金项目：河北省医学重点学科跟踪项目(No.GL201321)；河北省省级重大医学科研课题(No.zd2013049)；张家口市科学技术与发展指令计划资助项目(No.1012010D-1)

作者简介：张瑛(1977-)，女，河北张家口人，主管护师，骨科护士长。

Experimental Studies in Qigong Kangxian Fang and its Broken Prescriptions on Step in Immunologic Injury of Liver Fibrosis in Rats

LIANG Zhen-yu,CHEN Gui-min

(Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Qigong Kangxian Fang(QF)and its broken prescriptions on step in immunologic injury of liver fibrosis in rats.MethodsPorcine serum attack method was used to induce immunocomplex induced liver fibrosis rat model，50 male SD rats were randomly divided into five groups:normal control group、model control group、QF intervention group、Softening and Resolving Hard Mass herb intervention group.and promoting blood circulation for removing blood stasis intervention group.The whole experiment process was 8 weeks.TGF-β1,Smad2 and Smad3 of liver tissue were detected with method of immunohistochemistry.ResultsWith Drug intervention,treatment group showed significantly downregulated effect on anti-liver fibrosis factor TGF- β 1 levels,and Smad2,Smad3 expression was reduced.The Effect of QF is obvious than that of its broken prescriptions.ConclusionQigong Kangxian Fang(QF)and its broken prescriptions on rat liver fibrosis induced by transforming growth factor(TGF-β 1)and Smads family proteins have significant moderatin regulation.The intervention for liver fibrosis in rats,can be achieved and QF effect is obvious than that of its broken prescriptions.Therefore,the prevention and treatment of hepatic fibrosis in addition to the use of ordinary law hemorheologic agent and Softening and Resolving Hard Mass herb, is necessary for of replenishing qi to invigorate the spleen.This has certain directive significance to the clinical treatment of liver fibrosis.

Key words:Qigong Kangxian Fang；broken prescriptions；Liver fibrosis；transforming growth factor-β1；Smad2；Smad3

肝病中晚期多以正虚血瘀为病理基础，立益气活血、软坚散结法治疗。芪蚣抗纤方(QF)由黄芪、蜈蚣、山慈菇、三七、白术、桃仁、郁金等七味药组成，是治疗中晚期肝病的有效经验方，有良好的保肝、抗肝纤维化(HF)作用。前期研究表明，芪蚣抗纤方对免疫损伤性肝纤维化大鼠肝损害逆转作用良好，可以影响大鼠转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smads信号通路。本研究主要探讨芪蚣抗纤方全方及其拆方干预肝纤维化的作用，以期为肝纤维化治疗组方奠定实验基础。

1材料与方法

1.1　动物与试剂

1.1.1动物雄性SD健康大鼠50只，体质量(180±20)g，购自广州中医药大学实验动物中心，SPF级。许可证号：SCXK(粤)2008-0020。

1.1.2药品及制备芪蚣抗纤方(QF)全方：黄芪、蜈蚣、山慈姑、三七、白术等，QF拆方软坚散结药(蜈蚣、山慈姑)，QF拆方活血化瘀药(三七、桃仁、郁金)；全方及拆方均按标准工艺制成颗粒剂备用，每袋10 g，用时配成液体灌胃(生药含量1 g·mL-1)。本颗粒剂由河北北方学院附属医院第一制剂室惠赠。

1.1.3免疫组化试剂盒TGF-β1抗体(批号：BA0290)，Smad2、Smad3(批号：BA1396)，配套使用稀释液(1：100)(批号：SA1022)及DAB显色剂，均购自武汉博士德生物工程公司。酶免试剂盒TGF-β1(批号：E0124r)购自上海亚培生物制剂有限公司。

1.1.4仪器超净工作台(SW-CJ-IFD型,苏州净化设备厂)，光学显微镜(Olympus，日本)，ELx80O型全自动酶标仪(美国宝特)，RM2235型石蜡切片机(德国)，LEICA BX50(Olympus)图像分析仪等。

1.2　分组及方法

50只SD雄性大鼠随机分为正常对照组(10只)、模型对照组(10只)、QF干预组(10只)、软坚散结药干预组(10只)、活血药干预组(10只)。正常对照组给予生理盐水2次/周腹腔注射；其余各组均给予猪血清2次/周腹腔注射，诱导肝纤维化模型[3-4]；均注射8周。第5周开始，正常对照组和模型对照组灌服生理盐水20 mL·kg-1，1次·d-1；QF干预组给予芪蚣抗纤方全方(生药含量1 g·mL-1)灌胃，10 mL·kg-1，1次·d-1；软坚散结药干预组给予QF拆方软坚散结药(生药含量1 g·mL-1)灌胃，10 mL·kg-1，1次·d-1；活血药干预组给予QF拆方活血化瘀药(生药含量1 g·mL-1)灌胃，10 mL·kg-1，1次·d-1；连服4周，大鼠给药剂量按临床等效剂量与动物体质量折算而得。实验过程共8周，实验结束后,大鼠眼球放血制备血清备用，用于检测血清学指标。处死大鼠,于肝左叶取肝组织10%甲醛固定，制作石蜡切片以备免疫组化染色。

1.3　检测方法

1.3.1酶标仪采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定TGF-β1含量。处死动物后，将动物血注入塑料离心管内，4℃，3 500 r·min-1离心20 min，分离血清，吸入EP管内-20℃保存备用，操作步骤按试剂盒要求，酶标仪450 nm波长测量各孔的光密度值(OD值)。

1.3.2免疫组织化学染色测定TGF-β1和Smad2、Smad3阳性表达，免疫组化结果判定：阳性染色为棕黄色颗粒，采用北京航空航天大学真色彩病理图像分析系统分析结果，参照免疫组化显色标准略修改。每个指标的每个标本,取10个较好的高倍视野，按显色程度分弱、中、强3种,分别记以1、2、3分。按显色范围分为4度，①+:显色范围占高倍视野<25%；②++：显色占高倍视野25%~50%；③+++：显色占高倍视野50%~75%；④++++：显色占高倍视野>75%。将每个高倍视野显色程度和范围换算成“显色指数”，显色指数=显色程度×显色范围(+为1分、++为2分、+++为3分、++++为4分)，取其均数为每个检测指标的最终显色指数。

1.4　统计学方法

表1　酶免法TGF-β1含量测定结果比较　

2结果

2.1　TGF-β1含量比较

与正常组对照比较，模型对照组大鼠血清TGF-β1含量明显升高(P<0.01)；各药物干预组可明显下调TGF-β1水平(P<0.01)，组间差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.2　TGF-β1、Smad2、Smad3表达比较

与正常对照组相比，模型对照组、各个干预组TGF-β1、Smad2、Smad3表达均增加(P<0.01或P<0.05)。与模型对照组比较，QF干预组TGF-β1、Smad2、Smad3阳性表达均下降(P<0.01)，有接近正常组的趋势；软坚干预组、活血干预组均能使TGF-β蛋白的表达减少(P<0.05)；软坚干预组与模型对照组Smad2、Smad3表达比较差异无显著性(P>0.05)，活血干预组与模型对照组比较差异有显著性(P<0.05)(表2)。

表2　TGF-β1和Smad2、Smad3阳性表达比较　

2.3　免疫组织化学染色比较

正常肝组织中肝窦、胞浆仅微弱表达TGF-β1，显色淡(封三图1)；Smad3胞浆弱阳性表达，阳染面积<10%。模型对照组较正常对照组TGF-β1阳性信号明显增强，随着肝纤维化程度的逐步加重，显色大部分呈深棕黄色(封三图2)；Smad3胞浆阳性表达,核阴性(封三图3)。药物干预后，QF干预组Smad3阴性(封三图4)；软坚干预组TGF-β1阳性染色多在胞浆表达，呈弱阳性，程度较模型对照组有所减轻(封三图5)；活血干预组TGF-β1表达明显减少，散在分布于受损肝细胞内。

3讨论

肝纤维化是常见肝病并发症，为机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应，是影响慢性肝病预后的重要因素，也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节。既往的研究结果表明芪蚣抗纤方对免疫损伤性肝纤维化大鼠肝损害逆转作用良好，可以影响大鼠TGF-β1/Smads信号通路。本研究结果表明，芪蚣抗纤方全方及其拆方软坚散结药与活血药都有抗肝纤维化的作用，都能使TGF-β1水平明显下降，Smad2、Smad3表达减少，QF全方比拆方效果明显。

但益气健脾必不可少。芪蚣抗纤方全方具有益气健脾、活血化瘀、理血软坚之功效，正合肝纤维化的病机。本研究结果在肯定全方功效的同时，对软坚与活血法治疗肝纤维化的探讨也为临床上治疗肝纤维化组方思路有一定的指导意义。

目前对肝纤维化预防和治疗的研究，祖国传统医学多为研究药物在某个病理环节的作用，而对中药复方机理及筛选中药中有效成分研究仍较少。本研究主要探讨药物其作用机理，以期筛选出高效、配伍合理的抗肝纤维化中药复方制剂，为指导临床和开发高效、低毒、配伍科学的抗纤新药打下实验基础。

参考文献：

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[2]陈桂敏,梁振钰,高湲,等.芪蚣抗纤方对免疫损伤性肝纤维化大鼠TGF-β1/Smads信号通路影响.中华中医药杂志2011，26(8):1865-1867.

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[6]宋仕玲，龚作炯，张全荣.中药复方金三莪对肝纤维化大鼠的治疗作用及其机制研究.中草药,2004,35(3)：295.

[7]高冲,刘璐等.活血化瘀中药的药理作用研究进展.药物评价研究2013,36(1):64-68.

[责任编辑：李蓟龙英文编辑：谢利峰]

通信作者：杨新明(1963-)，男，河北石家庄人，教授，主任医师，硕士生导师。