当归红芪超滤物对衰老大鼠脑组织氧化损伤及线粒体DNA缺失的影响

当归红芪超滤物对衰老大鼠脑组织氧化损伤及线粒体DNA缺失的影响

李应东1刘萍萍周倩倩1孙少伯1刘凯1

(甘肃中医学院附属医院,甘肃兰州730000)

摘要〔〕目的探讨当归红芪超滤物延缓老龄大鼠脑衰老的作用及其机制。方法选用3月龄大鼠12只作为青年组，选用24月龄大鼠36只随机分为老年组、当归红芪超滤物组、维生素E组。给予相应处理后检测各组学习记忆功能、脑指数测定，组织形态学观察，脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力，丙二醛(MDA)含量测定及脑组织线粒体DNA(mt-DNA)缺失的表达。结果与青年组大鼠相比:老年组大鼠学习能力下降，脑组织形态学存在差异，脑指数存在差异(P<0.05)，脑组织SOD活力明显降低，MDA 含量明显升高，脑缺失mt-DNA/内参mt-DNA 比例明显增高(P<0.05)；与老年组相比:用药组大鼠学习能力明显增加，脑组织形态学存在差异，脑指数无明显差异，脑组织中SOD 活力显著增高，脑组织中MDA 含量显著降低，脑缺失mt-DNA/内参mt-DNA比例降低(P<0.05)。与维生素E组相比，用药组大鼠学习能力、脑指数、脑组织SOD 活力、MDA含量、脑缺失mt-DNA/内参mt-DNA比例均无显著差异(P>0.05)。结论当归红芪超滤物可能通过清除自由基，防止mt-DNA片段丢失发挥延缓老龄大鼠脑组织衰老的作用，其功效与维生素E相当。

关键词〔〕当归红芪超滤物；衰老；抗氧化；线粒体DNA

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家教育部“春晖计划”(No．Z2004-1-62042)

1甘肃中医学院

第一作者：李应东(1962-)，男，博士，教授，主任医师，博士生导师，主要从事心脑血管疾病研究。

Effect of ultra-filtration extract mixture from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys on the oxidative damage of brain tissues and the expression of the mt-DNA deletion in old rats

LI Ying-Dong,LIU Ping-Ping,ZHOU Qian-Qian，etal.

Affiliated Hospital of Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysari Polybotrys(UFE-AH) on slowing brain aging of old rats.Methods12 healthy male Wistar rats of 3-months old were selected for the youth control group,and 36 natural aging male Wistar rats of 24-months old were selected and randomly divided into three groups:the old control,UFE-AH and Vitamin E(VE) groups. After above treatments,the learning and memory ability and the brain index of each group of Wistar rats were measured,brain tissue(hippocampus and cortex) was observed by microscope,the activity of dismutase(SOD),contents of maloudialdehyde(MDA) and the expression of mitochondrial DNA(mt-DNA) deletion in the brains were tested. ResultsThe learning and memory ability of old rats decreased compared with the youth rats,there were significant difference in the brain tissue and brain index between the old and the youth(P<0.05). The activity of SOD apparently decreased,contents of MDA apparently increased,and the expression of mt-DNA deletion increased in old rats(P<0.05). Rats treated with UFE-AH had high learning and memory ability compared with the normal old rats,there were significant difference in the brain tissue,and there was no difference in brain index. The activity of SOD apparently increased,contents of MDA apparently decreased,and the expression of mt-DNA deletion decreased of rats treated with UFE-AH(P<0.05). Rats treated with UFE-AH had no significant differences with the rats treated with VE in above parameters. ConclusionsThe UFE-AH could slow brain aging of old rats by eliminating free oxygen radicals and preventing from mt-DNA deletion,whose function is similar with the VE.

【Key words】ApoC Ⅲ; mRNA; Bama; Longevity; RT-PCR

自由基学说是衰老的机制之一〔1〕。衰老是过量自由基攻击生物组织细胞、核酸和蛋白质，体内的抗氧化物质，致使损伤积累战胜了机体的修复能力，改变细胞分化状态,甚至丧失,从而导致衰老〔2〕。线粒体是细胞的能量中心，易产生氧自由基，自身又缺乏有效的清除系统，故线粒体DNA(mt-DNA)也是自由基损伤的重要目标〔3〕，这种损伤可使线粒体DNA发生突变，且随增龄逐渐积累，达到一定阈值后即可导致细胞能量危机造成机体生理功能的减退引起衰老〔4〕。线粒当归红芪超滤物合剂来自于当归,红芪按1∶5 配伍所组成的补气生血之经典名方当归补血汤，目前该提取物已被证实具有良好的抗自由基〔5〕，抗氧化损伤〔6〕，促进血管新生〔7〕等功效,但在抗衰老方面尚未见相关研究，本实验以10万分子量当归红芪超滤物作用于自然衰老雄性大鼠，通过检测学习记忆功能、脑指数，脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力，丙二醛(MDA)含量及脑组织mt-DNA，以期探讨其延缓脑衰老的作用及机制。

1材料与方法

1.1实验动物选用SPF级雄性3、24月龄的Wistar大鼠，实验动物购自甘肃中医学院医学实验中心，SPF级动物合格证号:SCXK(甘) 2011-0001。

1.2药品及试剂维生素E胶丸(青岛双鲸药业)；当归红芪超滤物(甘肃中西医结合研究所和甘肃省膜科院联合提供)；SOD试剂盒、MDA 试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(均购自南京建成生物研究所)；Go Taq Green master mix(美国Sigma公司)；mt-DNA引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)。

1.3仪器BP211D型电子天平(瑞士Sartorius公司)；UV-2401PC型紫外可见分光光度仪(日本岛津)；台式低温高速离心机(PLCO型，德国Heraeus公司)；MDF-382 型低温冰箱(日本三洋公司)；美国亚培全自动酶标分析仪；PCR扩增仪(PE2400型，美国PE公司)；Morris水迷宫实验系统和BI2000图像分析系统(成都泰盟公司)。

1.4动物分组与给药分组：选用SPF级雄性，3月龄的青年Wistar大鼠12只，体重(160.8±9.3)g，作为青年组(A组)；SPF级雄性，24月龄的老龄Wistar大鼠36只，体重(461.6±36.8)g，随机分为老年组、当归红芪超滤物组、维生素E组，每组12只，给药:各组大鼠在相同条件下适应性喂养7 d后，开始进行实验。当归红芪超滤物组给予10万分子量的当归红芪超滤物，每次19.428 g生药·kg-1·d-1(每克生药可提取10万分子量当归红芪超滤物0.111 g)，维生素E组给予维生素E，每次54 mg·kg-1·d-1，青年组和老年组均给予同体积生理盐水7 ml·kg-1·d-1，每天灌胃1次，连续70 d。

1.5大鼠学习记忆功能检测(水迷宫实验)70 d以后开始行Morris水迷宫实验，该实验分为定向航行实验和空间探索实验。先对大鼠进行3 d训练，第4天开始定向航行试验，记录第4、5天大鼠的逃避潜伏期，并取其平均值作为大鼠学习能力的检测指标。第6天行空间探索实验，记录大鼠穿越平台次数来作为判断大鼠记忆能力的指标。

1.6脑指数测定水迷宫测试结束，大鼠禁食12 h，测量记录大鼠体重(g)；注射水合氯醛麻醉固定，冰上快速取脑，盐水冲净并滤干，称取脑组织重量(g)；脑指数=脑重量/动物重量。

1.7光学显微镜下组织形态学观察称重完毕分离大鼠左侧颞叶大脑皮质和左侧海马，福尔马林溶液固定，不同浓度乙醇逐级脱水，二甲苯溶液，石蜡中浸泡后包埋，切片，然后脱蜡，染色、脱水、透明、封固、晾干，光学显微镜下观察组织形态。以上操作由甘肃中医学院病理教研室协助完成。

1.8生化法测定脑组织SOD活力、MDA含量剩余脑组织称重，用4℃生理盐水制备成1%，10%的组织匀浆，3 000 r/min，离心10 min，取上清液行SOD活力、MDA含量检测。采用黄嘌呤氧化酶法测定脑组织SOD活力,硫代巴比妥酸比色法测定MDA的含量，严格按试剂说明书进行操作。

1.9各组大鼠脑组织mt-DNA缺失表达的测定线粒体DNA 提取：参照北京天恩泽基因科技有限公司提供的柱式动物线粒体DNA提取试剂盒说明操作。引物设计：内参引物L4395-4418(5′-AGGACTTAACCAGACCCAAACACG-3′)和H5164-5145(5′-CCTTTTTCTGATAGGCGGG-3′)，用于扩增野生型mt-DNA片段，反映正常mtDNA 含量，以此作为内参照；缺失型引物L7825-7944(5′-TTTCTTCCCAAACCTTTCCT-3′)和H13117-13098(5′-AAGCCTGCTAGGATGCTTC-3′)，用于扩增缺失型mt-DNA 片段，反映片段缺失型mt-DNA 含量。PCR扩增：选择25 μl的反应体系，组成如下：Go Tap Green master mix,2×,12.5 μl；上游引物，10 μmol/L，2 μl；下游引物，10 μmol/L，2 μl；模板DNA ，5 μl；灭菌双蒸水，3.5 μl。PCR扩增条件：94℃，2 min；94℃，30 s；53℃30 s；74℃，60 s；74℃，5 min,25个循环。琼脂糖凝胶电泳：各组取10 μl扩增产物和上样缓冲液混匀后入琼脂糖凝胶孔中，一孔加Marker作参照。电泳完成后，在凝胶图像成像分析系统下获得图像并分析。

2结果

2.1大鼠学习记忆功能检测结果老年组同青年组相比潜伏期延长，平台搜索次数明显增加(P<0.05)，说明在衰老的过程中大鼠的学习记忆功能是下降的。与老年组比较，用药组潜伏期缩短，穿越平台次数均增加，10万分子量组差异最显著(P<0.05)。与维生素E组比较，用药组潜伏期及穿越平台次数无显著性差异(P>0.05)，说明当归红芪超滤物同维生素E在改善衰老的过程中大鼠的学习记忆功能是相当的。见表1。

2.2脑指数测定结果与青年组大鼠脑指数相比，老年组、当归红芪超滤物组及维生素E组脑指数存在差异(0.003 572±90.004 87、0.003 336±0.000 339，P<0.05)；用药组大鼠与衰老对照组相比，脑指数之间均无差异(P>0.05)。可见在衰老过程中会出现脑萎缩现象，当归红芪超滤物和维生素E对大鼠脑萎缩的改善并不明显。

2.3光学显微镜下组织形态学观察结果见图1。在光学显

组别n逃避潜伏期(s)穿越平台次数青年组1229.50±13.9822)3)10±2.7303)老年组1285.50±11.0231)3)2.92±1.7301)3)当归红芪超滤物组1243.33±23.8381)2)6.58±1.7301)维生素E组1148.60±21.2851)2)5.91±2.6631)2)

与青年组比较：1)P<0.05；与老年组比较：2)P<0.05；与维生素E组比较：3)P<0.05

图1　各组大鼠大脑皮质和海马区组织的形态(HE,×10)

微镜下青年组大鼠大脑皮质和海马区神经细胞丰富，层次清晰；衰老组大鼠大脑皮质和海马区神经细胞层次不清楚，排列稀疏、杂乱，脱失明显；当归红芪超滤物组大鼠大脑皮质和海马区神经细胞层次欠清楚，与老年组相比细胞脱失减轻；维生素组大鼠大脑皮质和海马区神经细胞层次欠清楚，细胞脱失较衰老组减轻。

2.4脑组织SOD活力、MDA含量测定结果与青年对照组比较，老年组大鼠脑组织中SOD活力明显降低，MDA 含量明显升高(P<0.05)；与老年组相比，当归红芪超滤物组大鼠脑组织中SOD 活力增高，MDA 含量降低(P<0.05)。与维生素E组比较，用药组大鼠脑组织中SOD活力、MDA 含量无显著差异(P>0.05)，说明用药组与维生素E组对衰老大鼠脑组织SOD活力、MDA含量影响作用是相当的。见表2。

2.5当归红芪超滤物对衰老大鼠脑组织mt-DNA缺失的影响与青年组比较，老年组大鼠脑组织缺失mt-DNA/内参mt-DNA比值升高(1.029±0.040 vs 0.298±0.007,P<0.01)；与老年组比较，当归红芪超滤物组大鼠脑组织缺失mt-DNA/内参mt-DNA比值下降(0.579±0.098，P<0.01)。与维生素E组比较，当归红芪超滤物组大鼠脑组织缺失mt-DNA/内参mt-DNA比值无显著差异(0.525±0.101，P>0.05)，说明当归红芪超滤物同维生素E在对衰老大鼠脑组织mt-DNA缺失的影响作用是相当的。见图2。

组 别nSOD活力(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)青年组12183.590±20.4482)3)1.411±0.2872)3)老年组1292.987±21.2461)3)7.678±0.7951)3)当归红芪超滤物组12141.132±18.2281)2)3.871±0.4731)2)维生素E组11132.181±8.0861)2)4.031±0.7631)2)

与青年组组比较：1)P<0.05；与老年组比较：2)P<0.05；与维生素E组比较：3)P<0.05

M:Marker；1：青年组缺失mt-DNA；2:青年组野生mt-DNA；3.老年组缺失mt-DNA；4.老年组野生mt-DNA；5当归红芪超滤物组缺失mt-DNA；6. 当归红芪超滤物组野生mt-DNA；7.维生素E组缺失mt-DNA；8.维生素E组野生mt-DNA 图2　各组大鼠脑组织mt-DNA缺失的凝胶成像图

3讨论

衰老的器官和组织主要表现在形态和功能两方面的变化，形态上表现为细胞数量减少，脏器萎缩和变性，引起相应生理功能逐渐减退〔8〕。神经系统在衰老过程中起着重要作用而且极易受损，体内外的有害物质通过作用于神经细胞而影响其衰老的进程〔9〕，伴随着年龄增长，衰老的脑组织会出现重量减轻，结构变化，进而影响其功能。在影响衰老的进程中氧自由基属决定性因素，起着至关重要的作用〔2〕，因此，增强机体抗自由基能力且减少脑组织自由基生成，维持它们之间的动态平衡便成为有延缓脑组织衰老，促进机体健康的有效方式。

中医学认为气和血是构成人体和维持人体的基本物质，气血的盛衰和运行状况与人体衰老有着密切的关系，气血亏虚是衰老的病机之一。中药当归，黄芪在临床上被广泛用于延缓衰老的治疗〔10〕。红芪属多岩序黄芪，甘肃道地药材，有研究显示红芪对自由基的清除效果优于黄芪，以自由基为诱因的疾病防治中优先选用红芪〔11，12〕。超滤技术可以保持药物有效组分的生理活性,显著提高药效〔13〕。

本实验采用自然衰老大鼠作为研究模型，更真实地模拟了衰老的生理变化过程〔14〕，通过检测显示老龄鼠学习记忆功能下降，脑指数降低，脑组织结构层次不清，排列杂乱，脱失比较明显，进一步检测显示，衰老脑组织SOD活力下降,MDA含量增加，mt-DNA缺失片段增加。而用当归红芪超滤物干涉虽然不能改变老龄鼠脑组织重量减轻的情况，但却可以明显改善老龄鼠的记忆功能，脑组织结构的紊乱，本研究发现当归红芪超滤物可能通过增加机体最重要的抗氧化酶——SOD的活力，降低自由基代谢产物——MDA的含量，从而有效地加强了机体抗氧化能力，减轻了自由基对mt-DNA的攻击，防止mt-DNA片段丢失而发挥良好的抗衰老作用，并且发现其功效作用同维生素E相当。本研究结果也提示益气活血方剂发挥其疗效作用的机制同抗氧化损伤密切相关，同时为益气活血法在抗衰老中的临床应用的提供了一定的实验依据。

4参考文献

1周文丽,张建鹏,冯伟华,等.脑衰老机制与脑疾病的关系〔J〕.生命的化学,2008;28(4):435-8.

2李素云,王立芹,郑稼琳.自由基与衰老的研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2007;27(20):2046-8.

3van Houten B,Woshner V,Santos H. Role of mitochondrial DNA in toxic responses to oxidative stress〔J〕. DNA Repair(Amst),2006;5(2):145-52.

4李豪杰,代会莹,扈盛.等.线粒体DNA突变与衰老〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(18):2714-6.

5李应东,赵信科,刘凯. 当归红芪超滤物对急性心肌梗死大鼠SOD、MDA、LDH1及HSP70的影响〔J〕.中华中医药杂志,2011;26(10):2430-3.

6马燕花,李应东,赵健雄,等.当归红芪超滤物对氧化损伤乳鼠心肌细胞的保护作用及其机制〔J〕.中草药,2010;41(4):602-7.

7刘凯.当归红芪合剂超滤膜提取物ECV-304 细胞血管内皮生长因子mRNA 表达的影响中〔J〕.中国中医药信息杂志,2010;17(3):36-8.

8曾尔亢,杨蕊敏,王红.等.衰老机制研究的新时代〔J〕.中国社会医学杂志,2006;23(2):74-6.

9王虎清.衰老过程中神经系统的作用〔J〕. 国外医学·老年医学分册,2008;29(2):53-6.

10覃骊兰,杨丽琴.延缓衰老复方用药规律的研究〔J〕.吉林中医药,2011；8(31):803-5.

11杨小虎,郭延生,曲亚玲,等.红芪、黄芪水提液体外清除自由基作用的研究〔J〕.甘肃农业大学学报,2010;45(4):42-5.

12胡燕,程卫东,刘欣,等.红芪和黄芪水提物对小鼠免疫功能影响的差异〔J〕.北京中医药大学学报,2011;34(9):623-6.

13邬方宁.膜分离技术在药物分离中的应用〔J〕.天津药学,2010；22(2):65-9.

14赵海军,王宝贵,张桂英,等.大豆多肽螯合锌对自然衰老小鼠的作用〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(29):1501-2.

〔2013-12-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)