真空回流提取-高效液相色谱法测定灯盏花中的槲皮素

张燕菊,许志刚,刘智敏,田世杰，张仙丽

(昆明理工大学 理学院，云南 昆明 650500)

真空回流提取-高效液相色谱法测定灯盏花中的槲皮素

张燕菊,许志刚*,刘智敏,田世杰，张仙丽

(昆明理工大学 理学院，云南 昆明 650500)

摘要：云南具有丰富的植物和药物资源，其主要成分的有效提取成为高效利用的关键．本文作者采用真空回流法提取灯盏花中的槲皮素黄酮化合物，优化了提取条件，结合高效液相色谱法对提取产物进行了测定，并与常压回流提取法进行了对照; 结合提取后样品的扫描电镜分析，探讨了不同提取方法对提取产物表观结构的影响.结果表明，真空联用提取法优于常压提取法，利用真空负压下的提取可避免黄酮化合物的氧化，提高提取效率．

关键词：灯盏花；槲皮素；真空回流提取；高效液相色谱法

黄酮类化合物是植物界分布最广的一类化合物，它集中分布于被子植物中，常以游离态或与糖结合成苷的形式存在．黄酮具有明显的抗氧化作用和脂质代谢调节作用，具有抗衰老、抗疲劳、抗过敏、抗菌抑菌、抗炎、抗癌、抗肿瘤、降血脂、增强免疫功能等功效，在医疗和保健方面有重要而广泛的应用[1]．槲皮素是重要的黄酮化合物之一，在槐花、槐米、桑叶、银杏叶、柴胡、鱼腥草、葡萄籽、人字草、金银花、车前草、槲树皮、杠板归、山楂等药材中均含有较多的槲皮素．

中草药有效成分的高效提取是植物资源充分利用的重要因素．传统的中草药提取方法有水煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流法、溶剂提取法、水蒸汽蒸馏法等.这些方法存在提取效率不高，杂质较多，提取液容易霉变，且加热过程易于破坏热敏性有效成分等缺点．在中草药现代化的进程中，逐步涌现出了一些新颖的提取方法和技术，如超声提取[2-3]、微波提取[4]、超临界流体萃取[5-6]、真空技术[7]、低温技术[8]等．对于一些热敏性有效成分，提取过程中需要防止被氧化和高温分解，因而对提取技术提出了更高的要求．真空技术常用于中草药提取后的浓缩环节，快速分离溶剂的同时保护了热敏性化合物.近年来真空技术开始应用于中草药的提取过程．在真空或负压的状态下，溶剂的沸点降低，可加快提取溶质的溶出，同时避免易氧化物质的氧化和热敏性化合物的分解．陈晓东[7]设计了用于中药提取的减压提取装置，不仅缩短了提取时间，提高了提取率，还有效的降低了能耗．XIAO等[9-11]设计了真空微波萃取装置用于中草药中易氧化和热敏性化合物的提取．宋春芳等[12]也设计了真空微波萃取装置用于竹叶中黄酮的提取．目前，真空技术在中草药有效成分提取中的应用报道并不多，而真空提取相对于常压高温提取已经显示出优越性，它尤其适用于提取化学稳定性差的成分．将真空技术与溶剂回流联用，对中草药中热敏性和易氧化成分的提取十分有利，不仅提取效率高、操作简便，还具有广泛的实用性．本文作者采用真空回流技术提取了云南特色中草药灯盏花中的槲皮素黄酮，并联用高效液相色谱进行测定．

1实验部分

1.1　仪器与试剂

仪器：戴安公司高效液相色谱仪(Dionex Ultimate 3000)，C18色谱柱(J&K Scientific LTD，5 μm，4.6 mm ×250 mm)，荷兰Philip扫描电镜(XL30 ESEM-TMP)．

试剂：灯盏花样品从昆明市菊花村中药市场购买，并经中国科学院昆明植物研究所标本馆鉴定；槲皮素标样购于陕西森弗高科实业有限公司(98%)；乙腈为色谱级，购于西陇化工股份有限公司；其余化学试剂为分析纯．

1.2　真空溶剂回流提取装置

采用50 mL的圆底烧瓶为提取瓶，水浴加热控制温度，上端连接冷凝回流管，顶端连接玻璃三通，通过真空水泵抽真空．随着水浴加热至回流状态，真空度稳定在0.07~0.08 MPa.旋转三通，关闭真空抽气泵.待装置气压稳定，可进行真空回流提取．提取结束后，先旋转三通，回复至常压．

1.3　实验方法

用电子天平准确称取1.00 g灯盏花粉末，置于50 mL圆底烧瓶中，加入一定量不同浓度的乙醇溶液，分别采取非真空溶剂回流提取和真空溶剂回流提取，对乙醇浓度、提取时间和固液比进行优化．得到的2个提取液经抽滤后收集滤液，旋转蒸发除去大部分溶剂，在3 000 r/min下高速离心，用乙酸乙酯萃取离心液两次，再将乙酸乙酯相转入50 mL 的圆底烧瓶中，旋转蒸干后用提取液定容至10 mL，待测，于进样前过滤(0.45 μm滤膜)．

1.4　色谱分析方法

流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液(体积比为30∶70)，流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm，柱温为30 ℃，进样为20 μL．采用峰面积进行定量，绘制峰面积对浓度的标准曲线，线性方程为Y=-0.26+0.86X，线性范围为0.5~10.0 mg/L，相关系数r=0.999 5．

2结果与讨论

2.1　槲皮素的提取工艺条件研究

2.1.1提取溶剂

采用15.0 mL的乙醇-水溶液作为提取剂，在沸水浴中提取60 min，提取剂中乙醇的体积分数分别选取为50%、60%、70%、80%和90%.提取后抽滤，滤渣再次提取，滤液合并.滤液在50 ℃下减压浓缩，浓缩液于3 000 r/min离心分离10 min，用15 mL的乙酸乙酯萃取浓缩液两次.将乙酸乙酯相转入50 mL的圆底烧瓶中，在50 ℃下旋转蒸发至干燥，用相应的乙醇提取液定容至10.00 mL，然后进行HPLC分析，并计算出样品中的槲皮素的质量．色谱分析结果如图1所示，可以看出，提取液浓度为70%时的提取效果最优；继续增加乙醇的浓度槲皮素难以溶出，提取率反而有所降低．因此，选择70%的乙醇溶液作为提取溶剂．

2.1.2提取时间

称取灯盏花样品1.00 g，以70%的乙醇水溶液为提取液，回流提取的时间分别设定为30、45、60、75和90 min，测定结果如图2所示．可以看出，随着提取时间的增加提取率逐步提高，但提取时间超过60 min以后提取效率略有降低．这可能是由于长时间的沸水浴加热，导致提取出来的黄酮产物受热分解，因此选择提取时间为60 min．

图1　乙醇浓度对灯盏花中槲皮素化合物的提取影响Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction amount of quercetin in Erigeron Breviscapus

图2　提取时间对槲皮素提取的影响Fig.2　Effect of extraction time on extraction amount of quercetin

2.1.3提取固液比

当样品质量为1.00 g，提取剂的体积分别为10、15、20、25和30 mL，考察了固液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30)对提取的影响．结果表明(图3)，当固液比为1∶15、1∶20、1∶25和1∶30时提取率都比较高，且1∶15提取效果最好，而固液比为1∶10时样品溶胀后浸没不充分，提取率较低，因此固液比选择1∶15．

2.2　提取样品中槲皮素的含量

采用优化的真空回流提取法对灯盏花样品中的槲皮素进行提取和高效液相色谱测定，并与常压下溶剂回流提取的方法进行对照(图4)．分析结果表明，真空溶剂回流提取联用高效液相色谱法测定灯盏花样品中的槲皮素，其萃取量可达0.068 4 mg/g(RSD=1.6%，n=5)；而非真空溶剂回流提取的萃取量仅为0.048 7 mg/g (RSD=5.7%，n=5)[13]，可见真空回流提取法的提取率高于非真空溶剂回流的提取率.这可能与提取过程中真空无氧环境有关，避免了槲皮素黄酮化合物的高温氧化；此外，真空负压条件下的提取有利于促进样品中分析物的溶出．

图3　固液比对槲皮素提取的影响Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of quercetin

(a)1 mg/L 槲皮素标样；(b)真空回流提取；(c)常压回流提取.图4　灯盏花提取液的色谱图分析图Fig.4　Chromatograms of of Erigeron Breviscapus extraction solution

2.3　样品提取前后的扫描电镜图

在1 000倍的放大倍数下，分别对真空回流提取(图5a)、常压回流提取(图5b)和未经萃取的灯盏花样品(图5c)进行了扫描电镜分析．相比于未经处理的样品，真空溶剂提取与非真空溶剂提取后的样品的表面结构都遭到明显破坏，并形成较多孔洞和坑洼；真空条件下提取的样品相比于常压下提取的样品，样品组织表面有更加明显的塌陷．这种变化有利于萃取溶剂的进入，溶解并释放细胞内的提取物质，从而进一步提高提取率[14]．

(a)真空溶剂回流萃取后的样品；(b)常压下溶剂提取过的样品；(c)萃取前的样品.图5　灯盏花样品萃取前后的扫描电镜对比图Fig.5　Scanning electron micrographs of Erigeron Breviscapus samples before and after extraction

3结论

建立了真空回流提取-高效液相色谱法测定灯盏花中槲皮素黄酮化合物的分析方法．真空溶剂回流的提取率为0.068 4 mg/g，而非真空溶剂回流的提取率仅为0.048 7 mg/g，可见真空回流提取法具有明显的优势．灯盏花样品提取前后的扫描电镜图进一步证实，相比于常压下提取的样品，真空条件下提取的样品表面有更加明显的塌陷和破坏，说明真空环境能促进样品的溶蚀，有利于萃取溶剂的进入和提取物的溶出．此外，真空条件还能避免黄酮化合物在高温下的氧化，从而获得更高的提取效率．

参考文献：

[1] 唐浩国.黄酮类化合物研究[M].北京:科学出版社,2009:1-10.

[2] SHIRSATH S R,SONAWANE S H,GOGATE P R.Intensification of extraction of natural products using ultrasonic irradiations—A review of current status[J].Chem Eng Process,2012,53:10-23.

[4] 童星,肖小华,邓建朝,等.低温微波技术在化学研究中的应用[J].化学进展,2010,22(12):2462-2468.

[6] HUANG Z,SHI X H,JIANG W J.Theoretical models for supercritical fluid extraction [J].J Chromatogr A,2012,1250:2-26.

[7] 陈晓东.用于中药提取的减压提取装置： 中国，2675123Y [P].2005-02-02.

[8] 李攻科,肖小华,宋伟.低温真空微波辅助提取方法及装置： 中国， 101342428A [P].2009-01-14.

[9] XIAO X H,SONG W,WANG J Y,et al.Microwave-assisted extraction performed in low temperature and in vacuo for the extraction of labile compounds in food samples [J].Anal Chim Acta,2012,712:85-93.

[10] WANG J X,XIAO X H,LI G K.Study of vacuum microwave-assisted extraction of polyphenolic compounds and pigment from Chinese herbs [J].J Chromatogr A,2008,1198/1199:45-53.

[11] 李攻科,汪军霞,肖小华,等.真空微波辅助提取技术及装置： 中国， 1824364A [P].2006-08-30.

[12] 宋春芳,翟新,于震,等.真空微波预辐射辅助提取竹叶黄酮工艺的优化[J].西北农林科技大学学报,2010,38(10):192-198.

[13] 张燕菊,刘智敏,许志刚.用高效液相色谱法测定灯盏花中槲皮素的含量[J].化学研究,2014,25(2):140-143.

[14] 卢彦芳,张福成,安静,等.微波辅助萃取应用研究进展[J].分析科学学报,2011,27(2):246-252.

[责任编辑：毛立群]

Determination of quercetin inErigeronBreviscapusby reflux

extraction under vacuum coupled with high performance

liquid chromatograph

ZHANG Yanju,XU Zhigang*,LIU Zhimin,TIAN Shijie,ZHANG Xianli

(FacultyofScience,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,Yunnan,China)

Abstract:Yunnan has abundant resources of plants and herbs,and the efficient applications of those plants and herbs naturally highly depend on the efficient extraction of the main components.Thus a vacuum reflux route was established to extract quercetion flavonoid from Erigeron Breviscapus.The extraction conditions were optimized.The extracted products were determined by high-performance liquid chromatograph (HPLC),while the extraction efficiency of the present route was compared with that of conventional atmosphere solvent reflux method.Moreover,the effects of different extraction methods on the appearance of the extracted products were investigated based on scanning electron microscopic observations.It was found that the vacuum extraction method is superior over atmosphere solvent reflux method,which is because the reflux extraction under vacuum favors to prevent flavonoids from oxidation and increase the extraction efficiency as well.

Keywords:Erigeron Breviscapus; quercetin; reflux extraction under vacuum; high performance liquid chromatograph

作者简介：张燕菊(1991-),女,本科生,从事色谱分析.*通讯联系人,E-mail：chemxuzg@kmust.edu.cn.

基金项目：国家自然科学基金项目(21205054)，昆明理工大学分析测试基金项目(20140956，20140597).

收稿日期：2014-09-04.

中图分类号：O 657.7

文献标志码：A

文章编号：1008-1011(2015)02-0158-04