酶催化光度法测定药物中的对乙酰氨基酚

酶催化光度法测定药物中的对乙酰氨基酚

黄秋丽 ， 杨倩倩 ， 陈亚红

(周口师范学院 化学化工学院 ， 河南 周口466000)

摘要：基于对乙酰氨基酚对牛血红蛋白模拟酶催化体系的抑制作用，建立了一种简单、灵敏的酶催化光度法测定对乙酰氨基酚的新方法。研究了该抑制反应的最佳实验条件及动力学行为，测定的线性范围为4.72×10-7～9.45×10-5mol/L，检出限为1.13×10-8mol/L。对浓度为4.72×10-6mol/L的对乙酰氨基酚进行11次平行测定，其相对标准偏差为2.1﹪。该方法可用于对乙酰氨基酚片中对乙酰氨基酚含量的测定。

关键词：卡托普利 ； 酶催化光度法 ； 血红蛋白

中图分类号：O657.32文献标识码：B

收稿日期：2014-12-29

基金项目：河南省教育厅基础前沿技术项目(No14A150015)，周口师范学院大学生科研创新

作者简介：黄秋丽(1993-)，女，本科在读；联系人：陈亚红(1975-)，女，博士，教授，从事分析化学的教学及分子光谱分析的研究工作；

目前文献报道的测定对乙酰氨基酚的方法主要有分光光度法[1-2]、高效液相色谱法[3]、 电化学分析法[4-5]、荧光光谱法[6]和化学发光法[7]等。酶促反应动力学分析法在临床、药物、农业、工业过程检测中都具有广泛应用，采用酶法分析对乙酰氨基酚还未见报道。

血红蛋白( Hb) 具有和天然生物酶辣根过氧化物酶(HRP) 相同的铁卟啉辅基和相似的空间结构，并且具有稳定、价廉的优点[9]。在碱性介质中，血红蛋白对过氧化氢氧化酸性铬蓝K具有强烈的催化作用，而对乙酰氨基酚对该体系具有强烈的抑制作用。据此建立了测定药剂中对乙酰氨基酚含量的酶催化动力学分析新方法。

1实验部分

1.1　试剂与仪器

JASCO-UV530型紫外—可见分光光度计(日本分光公司)；pHS-3C型酸度计(上海理达仪器厂)；电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)。牛血红蛋白(生化试剂；上海伯奥生物科学有限公司)；酸性铬蓝K(北京化学试剂厂)；H2O2溶液；NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液。

对乙酰氨基酚(上海瑞齐生物科技有限公司)标准溶液：准确称取0.142 8 g的对乙酰氨基酚对照品，加热水溶解后用蒸馏水稀释成100 mL，得到浓度为9.45×10-3mol/L的储备液(4 ℃冰箱保存)；工作液：用水稀释成9.45×10-4mol/L，现配现用。所用试剂均为分析纯，水均为二次蒸馏水。

1.2　实验方法

在10 mL比色管中依次加入pH值为10.7的NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液2.0 mL，浓度为1.0×10-4mol/L的酸性铬蓝K溶液4.8 mL，1.0×10-3mol/L的H2O2溶液1.1 mL，不同浓度的对乙酰氨基酚标准溶液，浓度为5.0×10-6mol/L的牛血红蛋白溶液2.0 mL，用二次蒸馏水定容。在室温下放置20 min后，用1 cm吸收皿，以蒸馏水作参比，在539 nm处测量吸光度。以不加牛血红蛋白和对乙酰氨基酚的试剂溶液为空白A0，不加对乙酰氨基酚的试剂溶液吸光度A1，加对乙酰氨基酚的试剂溶液吸光度A2，其计算抑制率[I(%)=100(A2-A1)/(A0-A1)]用所得抑制率对对乙酰氨基酚的浓度作标准曲线。

2结果与讨论

2.1　吸收光谱

在血红蛋白的催化作用下，H2O2能够氧化酸性铬兰K并使之褪色。实验发现，对乙酰氨基酚对此催化体系有强烈的抑制作用，藉此建立了一种催化光度法测定对乙酰氨基酚的新方法。如图1所示，最大吸收波长均为539 nm，加入血红蛋白后体系的吸光度明显降低(如图1中的2)，而加入对乙酰氨基酚后体系吸光度降低较少(如图1中的3)，表明对乙酰氨基酚对血红蛋白催化H2O2氧化酸性铬蓝K的体系有强烈的抑制作用。

E-mail：chen-yh75@163.com

1.空白：pH值10.7的NH 3-NH 4Cl+4.8×10 -5mol/L酸性铬蓝水+1.1×10 -4mol/L H 2O；2.空白+1.1×10 -6mol/L血红蛋白；3.空白+9.45×10 -5mol/L对乙酰氨基酚+1.0×10 -6mol/L血红蛋白。 图1　体系的吸收光谱

2.2　测定条件的优化

2.2.1酸度条件的选择

通过实验分别考察了pH值为9.5、9.8、10.1、10.4、10.7、11.0的NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液对体系的影响，见图2。实验发现，不同pH值的NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液对该体系有不同程度的影响。结果表明：在pH值10.7的NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液介质中，对乙酰氨基酚对体系的抑制作用最强。因此，本实验选择pH值为10.7的NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液。

图2　酸度的影响

2.2.2酸性铬兰K浓度的影响

分别试验了不同浓度的酸性铬兰K对该体系的影响，结果见图3。随着酸性铬兰K浓度的增大，对乙酰氨基酚对体系的抑制作用逐渐增强。当酸性铬兰K溶液的浓度超过4.8×10-5mol/L时抑制作用达最大值且趋于稳定。因此，实验选择酸性铬兰K溶液的最佳浓度为4.8×10-5mol/L。

图3　酸性铬蓝K浓度的影响

2.2.3H2O2浓度的影响

H2O2在反应体系中作为氢受体底物，它的浓度直接影响到反应的速度和完全程度(见图4)。浓度过高，对乙酰氨基酚易被氧化；浓度过低，氧化反应不完全。选择H2O2的浓度为1.1×10-4mol/L。

图4　H 2O 2浓度的影响

2.2.4血红蛋白浓度的影响

分别试验了不同浓度的血红蛋白对体系的影响。结果表明：随着血红蛋白浓度的增大，对乙酰氨基酚对体系的抑制作用先增大再逐渐减小，当血红蛋白的浓度为1.0×10-6mol/L时，对乙酰氨基酚对体系的抑制作用最强(如图5所示)。所以，试验选择血红蛋白的浓度为1.0×10-6mol/L。

图5　血红蛋白浓度的影响

2.2.5反应时间的确定

研究了不同对乙酰氨基酚浓度下反应的动力学行为。随着对乙酰氨基酚浓度的增大，其对体系的抑制作用也逐渐增强；同时发现，随着时间的延长，反应速度逐渐减慢，室温20 min 后体系趋于稳定，因此，选择20 min作为体系的反应时间。

2.3　分析方法特性

在上述最佳实验条件下按实验方法绘制标准曲线。对乙酰氨基酚的浓度在4.72×10-7～9.45×10-5mol/L范围内与抑制率有良好的线性关系。其线性回归方程为：

I(%)=(16.909 8±2.582 4)+(5.193 8±

其中，r为线性相关系数，n为实验次数。方法检出限，经3Sb/k(Sb为11次空白信号的相对标准偏差，k为线性方程的校正斜率)计算，得该方法的检出限为1.13×10-8mol/L。对浓度为4.72×10-6mol/L的对乙酰氨基酚进行11次平行测定相对标准偏差为2.1%，表明该方法具有较好的重现性和精密度。将本法与其他测定方法进行比较(见表1)，可知本法具有较高的灵敏度。

表1　乙酰氨基酚不同测定方法反应特性比较

2.4　共存物质影响

2.5　样品分析

取药品10片(河北冀衡药业有限公司)，称重后研细，准确称取0.1690 g细粉(约相当于对乙酰氨基酚0.142 8 g)，用热水溶解，再用蒸馏水定容成100 mL，摇匀。用干燥的定量滤纸过滤。取滤液适量，用蒸馏水稀释10倍后，按实验方法对其进行测定。同时进行加标回收实验，结果见表2，从表2中看出，回收率为：99.6%～102.3%。结果满意。

表2　样品分析结果( n=5)

参考文献：

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