絮凝剂发酵制备条件暨性能研究

絮凝剂发酵制备条件暨性能研究

马玮超 ， 雷磊 ， 陈五岭

(西北大学 生命科学院 ， 陕西 西安710069)

摘要：以筛出的高效絮凝剂产生菌为对象，利用高岭土悬液处理前后紫外吸光值的变化测定絮凝效果。絮凝剂主要在对数期、稳定期产生，衰亡期初期积累量达到最大。C∶N为7∶1时最有利于菌体增殖，13∶1时最有利于絮凝剂产生。菌体可利用多种常见基质产生絮凝剂。其化学成分为多糖和蛋白，有效成分主要是多糖。絮凝剂可适应较大范围pH值、温度变化，多种金属阳离子均可加强絮凝效果，最佳投量是0.2 g/L。

关键词：絮凝剂 ； 发酵 ； 性能

中图分类号：X703.5文献标识码：A

收稿日期：2014-12-21

作者简介：马玮超(1990-)，男，硕士在读，电话：15991687042；联系人：陈五岭(1954-)，男，教授，博士生导师，从事应用微生物研究，电话：13991993298。

Study on Preparation Conditions of Flocculant by Fermentation and Its Performance

MA Weichao , LEI Lei , CHEN Wuling

(Life Science Institute ， Northeast University ， Xi′an710069 , China)

Abstract:Microbe able to produce flocculant efficiently we choose a selected as research object，its effect is tested by examining variation of ultraviolet absorption of kaolin suspension after being dealt with. Production mainly generated in log phase as well as stationary phase，and attains the maximum in decline phase.When the carbon/nitrogen ratio is 7∶1，cells grow readily,when it is 13∶1，accumulation of flocculant attains the maximum.The microbe is able to utilize medium from wide sources. The flocculant is composed of protein and polysaccharide and main effective chemicals is polysaccharide. The flocculant is geared to high temperature，wide pH value range metal positive ions can reinforce its effect,the best put volume is 0.2 g/L。

Key words:flocculant ; fermentation ; performance

目前大量使用的无机絮凝剂、高分子絮凝剂，存在用量大、易造成二次污染的弊端。微生物絮凝剂本身是生化物质，可自然降解，使用过程均无二次污染，用量小但作用明显，具有很强的应用价值，可利用液体发酵手段实现工业生产[1-3]。

利用发酵手段生产絮凝剂，主要目的是获取产物，控制成本。产物积累量与菌体生长周期关系密切，碳氮比可深刻影响菌种扩繁、产物积累。菌种可利用的基质来源决定着生产成本。检验产物价值的主要指标是产物受环境因子的影响程度、投放量、性能稳定性[4-7]。鉴于此，将以上问题作为研究重点，在本项目中研究。

1实验部分

1.1　材料与仪器

仪器：VIS-7220N紫外分光光度计，ZHCHENG振荡培养箱，PHS-3C型pH计，AIRTECH超净工作台，HIRAYAMA高压蒸汽灭菌釜，TDL-5A菲恰尔离心机，水浴锅，移液枪，电子天平，62 μm(230目)筛。

菌株：本实验室自西北大学垃圾填埋场渗液中筛选的一株高效絮凝剂产生菌，按《伯杰氏系统细菌手册第八版》生理生化鉴定，确认为一株芽孢杆菌(Bacillus. spp)。

试剂：去离子水，乙醇，丙酮，高岭土，蛋白酶K，牛血清蛋白，葡萄糖，硫酸铜，苯酚，酒石酸钾，烧碱，盐酸。

碳源：乳糖，蔗糖，麦芽糖，红薯粉，草酸钠，乳酸钠。

氮源：鱼粉，花生粉，玉米浆。尿素，硫酸铵，氯化铵。

培养条件：175 r/min，pH值为8 ，温度32 ℃。

1.2　絮凝剂精提方法

取发酵液，烧碱质量分数为3%，充分搅拌，4 000 r/min离心15 min后取上清液。用95%乙醇调乙醇浓度至70%，冰箱冷冻至4 ℃保持5 h，离心弃去上清液。用丙酮调浓度至90%，离心得沉淀。取少许去离子水透析2～3次，去除溶液中所含盐分，冷冻干燥得到精提絮凝剂。

1.3　絮凝活性测定

高岭土高温烘焙，230目过筛后，配置为0.5%质量比的悬液。将待检验发酵液加入悬浊液中，快速搅拌1 min，再缓慢搅拌5 min，用紫外分光光度计在550 nm波长处，按空白对照(相同处理时间内高岭土自然沉降为对照)调零后，测定处理前后OD值。

R=(A-B)/A

式中，R为絮凝率，A为处理前光吸收值，B为处理后光吸收值。以R值大小反映絮凝活性。

1.4　絮凝剂积累与菌体生长关系测定

添加葡萄糖12.5 g，硝酸铵2.5 g，按1.1中条件培养，每隔10 h，在620 nm(本菌株最大光吸收波长)处测定发酵液光吸收值(以未接种发酵液空白对照)。测定发酵液絮凝率，得到最大积累量达到时间。

1.5　基质影响测定

1.5.1碳氮比影响测定

定总基质量15 g，按设定的梯度碳氮比， 1.1中培养条件，以葡萄糖为碳源，硝酸铵为氮源，测定絮凝率、OD620的不同。

1.5.2基质成分影响测定

在产物积累的最佳碳氮比下，按1.1中条件培养，测定氮源影响时以葡萄糖为唯一碳源，测定氮源影响时以硝酸铵为唯一氮源，分别测定絮凝率。

1.6　絮凝剂性能测定

1.6.1絮凝剂有效成分测定

蛋白含量采用双缩脲法测定。按浓度梯度0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/L配制牛血清标准溶液1 mL，分别添加4 mL双缩脲溶液(去离子水溶解1.5 g硫酸铜，6 g酒石酸钾，再添加15 mL 20%烧碱，定容至100 mL)，振荡后静置30 min，540 nm处测光吸收值。

多糖含量采用苯酚硫酸法测定。按浓度梯度0、1、2、3、4、5、6 mg/L配制葡萄糖标准溶液2 mL，分别添加5 mL 98%浓硫酸，1 mL 6%苯酚，振荡后静置30 min。490 nm处测光吸收值。利用Eexcel 2003软件生成以上二者标准曲线。取精提絮凝剂0.1 g，溶于20 mL去离子水，再取1 mL溶液，去离子水定容至100 mL。取1、2 mL此溶液分别经双缩脲法、苯酚硫酸法，测定光吸收值，代入标准曲线公式，得到蛋白、多糖浓度，换算即可得二者在絮凝剂中的百分含量。

取0.1 g絮凝剂溶解于40 mL去离子水，用移液枪取10 μL蛋白酶K加入溶液，充分振荡，水浴保温处理30 min。再取1 mL溶液加于14 mL高岭土悬液中，测定絮凝率，即可确定有效成分。

1.6.2环境因子影响测定

测定基质碳氮比、成分影响时，取1 mL发酵液滴于14 mL高岭土悬浊液中，水调温30 ℃，调pH值为7。

测热稳定性时，最佳碳氮比下培养，调pH值为7，絮凝剂分别60、70、80、90、100 ℃下水浴30 min后使用。

测pH值变化的影响时，在最佳碳氮比下培养，30 ℃下调至对应pH值，静置30 min。

测金属阳离子影响时，最佳碳氮比下培养，分别加0.1 mol/L MgCl2和CaCl2，0.2 mol/L NaCl和KCl，0.067 mol/L FeCl3和AlCl3溶液10 mL，发酵液1 mL于139 mL高岭土悬浊液当中。调pH值为7，水浴调温30 ℃。

1.6.3最佳投料量测定

0.1 g精提絮凝剂溶于40 mL蒸馏水配成溶液。依次向49、48、47、46、45、44、43、42 mL高岭土悬浊液添加1、2、3、4、5、6、7、8 mL溶液，水浴调节温度至30 ℃，pH值为7，测定絮凝率，得到最佳投量后换算为每升投量克数。

1.6.4絮凝剂性能稳定性测定

连续转接菌种于牛肉膏蛋白胨斜面上，每培养1 d记为1代，记第1代为G1。每隔3代取一株菌最佳碳氮比下发酵培养，精提絮凝剂。分别提取对应代数发酵液絮凝剂0.1 g，溶解于40 mL去离子水中，再取1 mL溶液加于14 mL高岭土悬液中测定絮凝率，水浴调温至30 ℃，pH值为7。利用SPSS20.0进行单样本T检验，测定性能、稳定性。

2结果和分析

2.1　絮凝剂积累与菌体生长关系测定

絮凝剂积累与菌体生长关系测定结果见图1。

由图1可知，菌体对数期(1～20 h)絮凝剂迅速增长，在稳定期(20～80 h)积累速度明显放缓，衰亡期(80 h后)初期积累量达到最大，而在衰亡期迅速下降。说明絮凝活性物质应当是伴随菌体生活始终产生的物质，对数期菌体浓度不大，产物迅速积累。

图1　絮凝剂积累与菌体生长的关系

稳定期积累放缓可能是因为絮凝剂影响到了菌类正常生活，分泌降解酶使之略有消解。而衰亡期初期积累量最大，应当是菌体裂解释放产物所致，随后积累量迅速下降，应当是环境恶化，产物成为营养源被分解利用。因此，最佳放罐时间是衰亡期的初期，生产中可通过监控OD值控制放罐时间。

2.2　基质对产物积累影响

2.2.1碳氮比的影响

碳氮比影响的测定结果如表1～3所示。

表1　碳氮比的影响

由表1可知，碳氮比为12∶1时絮凝性能最佳，碳氮比为8∶1时菌体细胞最多。在此基础上设置更小梯度进一步研究。

表2　碳氮比对菌体生长影响

表3　碳氮比对絮凝剂积累影响

由表2、表3结果可知，扩繁菌体的最佳碳氮比为7∶1。实际生产中适合作为种子发酵时的基质投料参数。积累絮凝剂的最佳碳氮比是13∶1，实际生产中适合作为絮凝剂发酵积累过程的基质投料参数。

2.2.2基质成分的影响

表4　碳源对絮凝剂积累的影响

由表4可知，菌株可利用多种常见碳源高效积累絮凝剂，其中蔗糖效果最佳，而葡萄糖尽管效果略低，但可结合工业上广泛应用的淀粉糖化技术实现规模生产。草酸钠、乳酸钠两种有机酸盐明显不利于产物积累。

表5　氮源对絮凝剂积累的影响

由表5可知，多种常见有机、无机氮源均有利于产物高效积累，其中鱼粉效果最佳，可能是因为其由动物组织制成，富含生长因子的原因。实际生产中可根据各原料的实际成本和产品效益选择适当的碳源、氮源组织生产。

2.3　环境因子对性能影响

2.3.1絮凝剂有效成分测定

按1.6.1方法，测定不同浓度标准溶液下的吸光值，结果如表6、表7所示。并得到对应标准曲线。蛋白标准曲线如图2所示，葡萄糖标准曲线如图3所示。

表6　不同浓度牛血清蛋白对应吸光值

图2　牛血清蛋白标准曲线

编号0123456浓度/mg·L-101.02.03.04.05.06.0吸光值0.0730.1830.3050.3940.5120.6240.73200.1100.2320.3210.4390.5510.659

图3　葡萄糖标准曲线

絮凝剂稀释溶液分别利用双缩脲法、硫酸苯酚法测定蛋白、多糖含量，测定处理后的絮凝剂溶液光吸收值1.228、0.813。分别代入对应的标准曲线公式，得蛋白含量为3.462 mg/L，多糖含量为7.42 mg/L，每升发酵液中共提取2.51 g产品，换算后每升发酵液提取絮凝剂可得多糖1.49 g(59.36%)，含蛋白0.87 g(34.62%)。

图4　絮凝剂蛋白酶处理前后絮凝活性变化

如图4所示，广谱蛋白酶K处理后，絮凝剂的絮凝效果略微有所下降，但下降值远远低于蛋白含量(34.66%)，说明絮凝剂活性成分由多糖和蛋白类物质组成，但主要的活性成分是多糖类物质。

2.3.2絮凝剂热稳定性

由于微生物絮凝剂的化学本质是生化物质，较高的温度能够极大的影响其化学结构稳定性，进而影响絮凝活性(见图5)。由图5可知，经60～80 ℃热处理后，絮凝剂的絮凝效果几乎不变，而经过90、100 ℃热处理后，絮凝效果略有下降。结合2.3.1中絮凝剂主要有效成分为多糖类物质，并含有蛋白的结果，应当是絮凝剂中的蛋白质成分在高温下变性，会导致其失去絮凝活力。可知絮凝剂性能具有较好的热稳定性，沸水处理后性能下降亦不明显。

图5　絮凝剂热稳定性

2.3.3pH值对絮凝活性的影响

图6　pH值对絮凝活性的影响

pH值对絮凝活性的影响如图6所示。强酸环境下，絮凝剂絮凝活性受到强烈抑制，随着pH值逐渐升高，絮凝活性迅速提高，pH值大于5后达到峰值。原因可能是，絮凝活性的实现主要是依靠官能团的电解，絮凝剂是弱酸性电解质，强酸环境抑制了其电解。pH值过高(大于13)时絮凝活性略微下降，可能是絮凝剂的蛋白组分被破坏，导致絮凝活性略有下降。但絮凝剂在pH值5～14絮凝活性均在80%左右。具有克服目前大量应用的高分子絮凝剂、无机絮凝剂使用pH值范围较窄缺陷的潜在价值[8]。

2.3.4金属离子对絮凝活性影响

图7　金属阳离子对絮凝活性的影响

Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+均可显著增强絮凝剂的絮凝效果。其中钠、钾离子促进效果相对有限，钙离子促进效果最佳。实际应用中，铝有较大的毒性，危害人体健康，钠、钾促进效果较差，铁的着色效果较强，可考虑使用镁、钙盐类作为助剂，与微生物絮凝剂复配，达到最佳的絮凝效果。

2.4　絮凝剂添加量对絮凝率的影响

絮凝剂添加量对絮凝率的影响如图8所示。

图8　絮凝剂添加量对絮凝活性影响

由图8可知，絮凝剂溶液添加1～4 mL时，絮凝活性与添加量成正比，超过4 mL反而下降。4 mL时达到絮凝率85.2%。经过换算最佳的投量为0.2 g/L。这是絮凝剂通过破坏悬浊物质的稳定结构使其从分散系中沉淀出来。过高浓度的絮凝剂浓度，反而使得沉淀重新形成稳定悬浊物。

2.5　絮凝剂性能稳定性分析

按1.6.4中方法，测定本菌的发酵液絮凝活性为86.3%。见表8。

表8　传代菌所产絮凝剂活性变化

经单样本T检验，Sig为0.889，远大于0.05，说明各传代菌株产生的絮凝剂性能差异不显著，产品性能稳定。这对于化工产品性质均一、稳定的保持具有很强的实际意义，也有利于处理时投料量的把握。

3结论

絮凝剂最大产量在衰亡初期达到，因此衰亡期初期适合作为放罐时间。絮凝剂产生菌可适应多种常见基质，便于控制成本。菌体扩繁的最佳碳氮比是7∶1，最佳产物积累碳氮比是13∶1。絮凝剂可适应较广pH值，高温处理后絮凝活性变化不大。在强酸性环境下絮凝活性受到强烈抑制，pH值超过5后达到最大絮凝活性，过高碱性环境下则活性略下降。高温处理后絮凝活性变化不大。多种金属阳离子均对絮凝效果有显著地促进作用。絮凝剂的最佳投料量是0.2 g/L，用量过大反而使得絮凝效果下降。菌种所产絮凝剂性能稳定，适合生产应用。

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