响应面法优化超声波辅助亚麻木酚素提取工艺及抗氧化性研究

李会珍 李 娜 张志军 李晓君 陈 铁

响应面法优化超声波辅助亚麻木酚素提取工艺及抗氧化性研究

李会珍 李 娜 张志军 李晓君 陈 铁

（中北大学化工与环境学院，太原 030051）

以亚麻籽为原料，对超声波辅助提取亚麻木酚素进行了研究。通过单因素试验，分别考察原料颗粒度、超声功率、液固比、超声温度和超声时间对亚麻木酚素得率的影响。并在单因素试验基础上，采用Box－Behnken中心组合设计和响应面法对超声波提取亚麻木酚素工艺进行优化，建立了二次多项式回归方程的预测模型。研究结果表明，超声波辅助提取亚麻木酚素的最佳工艺条件为：原料颗粒度60目，提取溶剂60%乙醇，超声功率400 W，液固比17∶1，超声温度40℃，超声时间15 min，亚麻木酚素得率为7.18 mg／g。抗氧化活性研究表明，亚麻木酚素对DPPH、过氧化氢和超氧阴离子均有良好的清除能力，IC50值分别为145 mg／L、75 mg／L 和0.25 mg／L。

亚麻籽 木酚素 超声波 响应面法 抗氧化性

亚麻（linum usititatissimum Linaceae），俗称“胡麻”，属于亚麻科亚麻属一年生草本植物，是世界十大油料作物之一［1－2］。亚麻籽含有丰富的脂肪酸、蛋白质、矿物质、维生素及酚酸类、黄酮类等营养成分。由于亚麻籽富含必需脂肪酸—α－亚麻酸（LNA）和亚油酸（LA），且这两种脂肪酸的比例比较适合人类营养需求，因此亚麻籽一直被认为是人类获取必需脂肪酸的最佳来源。但是，近年来研究发现，亚麻籽中还含有一种很具开发潜力的成分——木酚素，是存在于亚麻籽种皮中的一种生理活性物质，一般约占籽粒质量的0.9% ～1.5%，比其他已知含木酚素的66种食品高75～800倍［3］。亚麻木酚素又叫开环异落叶松酚二葡萄糖苷（SDG，Secoisolariciresinol Diglucoside），是与人体雌激素十分相似的植物激素，对雌激素依赖性疾病乳腺癌、前列腺癌、经期综合征、骨质疏松等有较好的预防作用。除此之外，临床研究显示亚麻木酚素具有抗氧化性，而且对糖尿病、胃肠肿瘤、冠心病、肾脏病，抗氧化性都有有益的作用［4－7］。近年来，符合疗效性要求的高纯度标准化木酚素提取物产品也已上市，可广泛应用于胶囊压片、谷物早餐和快餐食品的添加剂。而中国是亚麻生产大国，开发利用亚麻木酚素具有广阔的市场前景和研究意义。

目前，亚麻木酚素的提取方法主要有溶剂萃取法［8］、亚临界水提取［9－10］、超临界CO2萃取法和酶法［11］等。溶剂萃取法虽然成本较低，但是耗时太长，提取率低。超临界CO2萃取法和酶法则存在成本较高，不易推广的缺点。超声波辅助提取技术以其溶剂耗量少，省时高效的特点而得到广泛应用［3］。本试验以Box－Benhnken中心组合设计原理和响应面法，对亚麻木酚素超声波辅助提取工艺进行优化，以期获得最佳提取工艺，并对其抗氧化活性进行研究，以期为亚麻木酚素的开发和应用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料和主要仪器

亚麻籽：中北大学生物资源化工研究所。开环异落叶松树脂酚（SECO）标样：纯度95%，Sigma公司。正己烷、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、磷钼酸等：均为分析纯，天津光复试剂厂。

UV－9600紫外可见光分光光度计：北京瑞丽分析仪器有限公司；TH－400BQG数控超声波清洗器：济宁天华超声电子仪器有限公司；DHG－9023A电热恒温鼓风干燥箱：上海申光仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 磷钼酸显色法测定亚麻木酚素标准曲线

以甲醇溶解SECO，配制浓度为11.65μg／mL的标准液。分别移取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 标准液至20 mL试管中，各加入3倍体积5%的磷钼酸乙醇溶液（g／mL），在80℃水浴中蒸去溶剂，将各管移入沸水浴中加热15 min，然后流水冷却，加入10 mL蒸馏水，振荡至完全溶解，然后用紫外可见分光光度计进行波长扫描，确定最大吸收波长，在最大吸收波长下测定各处理的吸光值，以浓度对吸光值做标准曲线。

1.2.2 亚麻木酚素提取及得率测定

将亚麻籽粉碎后过20、40、60、80、100 目筛，分别与正己烷1∶6混合脱脂10 h后，3 000 r／min离心20 min，脱脂粉末于40℃下热风干燥。准确称取脱脂亚麻籽粉3 g放入三角瓶中，按一定的固液比加入60%的乙醇溶液封口，设置一定的超声功率、超声温度和超声时间，每隔5 min震荡1次，使其超声均匀。超声结束后，抽滤，测定滤出醇提液体积。量取一定量的醇提液放入试管中，加入1 mol／L的NaOH，使醇提液中NaOH浓度调至0.25 mol／L，碱解2 h。碱解结束后加入1 mol／L的盐酸调节pH至4.0。用0.45 μm醋酸纤维素膜微滤。采用正丁醇萃取，减压浓缩，甲醇复溶移至容量瓶中，如1.2.1操作进行测定。亚麻木酚素得率按下面公式计算。

1.2.3 单因素试验

分别考察原料颗粒度20、40、60、80、100 目；超声功率300、350、400、450、500 W；液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1；超声温度30、35、40、45、50 ℃；超声时间10、15、20、25、30 min 对亚麻木酚素得率的影响。从试验结果分析确定考察区间，以此作为中心组合设计试验方案的基础。

1.2.4 响应面法优化提取工艺

采用Box－Behnken中心组合设计原理和响应面法优化亚麻木酚素的提取工艺。在单因素试验的基础上，采用颗粒度为60目的脱脂亚麻籽粉为原料，60%乙醇为提取溶剂，提取功率400 W，以得率为响应值（Y），以液固比（X1）、超声温度（X2）和超声时间（X3）分别为自变量，设计中心组合试验。

表1 中心组合设计试验的因素与水平表

1.2.5 抗氧化能力测定

DPPH·自由基清除能力按郭雪峰等［12］方法测定，略有改动。10 mL比色管中依次加入4.0 mL 51.3 mg／L DPPH·溶液和1.0 mL 95%乙醇，混匀反应稳定后，以95%乙醇液为参比，在518 nm处测吸光值，记为A0；同法依次加入95%的乙醇溶液4.0 mL和1.0 mL待测试样溶液，测定吸光值，记为Ar；依次加入4.0 mL 51.3 mg／L DPPH·溶液和1.0 mL待测试液，测定吸光值，记为As。计算自由基清除率（Y）＝［1－（As－Ar）／A0］×100%。清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度即为半数抑制率IC50值（mg／L）。

过氧化氢（H2O2）清除能力按刘大川等［13］的方法测定。超氧阴离子自由基（O2－·）清除能力按郭雪峰等［14］的方法测定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

亚麻木酚素的标准曲线方程为Y＝0．203 8X－0．009，相关系数R2为0.996 6，表明相关度高，可以用此标准曲线计算木酚素的含量。

图1 磷钼酸显色法测定亚麻木酚素的标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 原料颗粒度的影响

以粉碎后分别过20、40、60、80、100 目筛的亚麻籽粉为原料，在液固比15∶1，超声温度40℃，超声时间20 min条件下，以产物得率比较不同颗粒度原料的效果（见图2）。试验结果表明，原料的颗粒度大小对得率的影响较大，随着颗粒度的减小得率先增加后减小，在60目时达到最大值。这是因为随着筛子孔径逐渐减小，杂质逐渐被挑出，在后续工艺中能够与有机溶剂充分混合，使提取率大大增加。但是在筛孔达到80目之后，部分亚麻籽粉也被筛孔阻隔，造成了试验材料的极大浪费。综合考虑试验成本，提取原料的颗粒度应采用60目。

图2 原料颗粒度对亚麻木酚素得率的影响

2.2.2 超声功率的影响

以颗粒度为60目的亚麻籽粉为原料（下同），在液固比15∶1，超声温度40℃，超声时间20 min条件下，分别以300、350、400、450、500 W 超声功率进行提取（见图3）。试验结果表明，在功率达到400 W之前，亚麻木酚素得率随超声功率的增大而增大，当超过400 W后亚麻木酚素得率逐渐下降，说明功率过大会破坏亚麻木酚素而使得率下降。综合考虑试验需求，选择400 W对亚麻木酚素进行提取。

图3 超声功率对亚麻木酚素得率的影响

2.2.3 液固比的影响

超声温度40℃，超声时间20 min，超声功率400 W的条件下，液固比对亚麻木酚素得率的影响见图4。随着液固比的增大，提取物得率在15∶1和20∶1时达到最大值，继续增大液固比，得率反而有所下降，这是因为当溶剂过量会造成超声作用不完全，不能将所有的细胞壁震破，而导致木酚素得率偏低，综合考虑生产成本，选择15∶1为响应面设计试验的中心水平因素。

图4 液固比对亚麻木酚素得率的影响

2.2.4 提取温度的影响

在超声功率400 W，液固比15∶1，提取时间20 min的条件下，超声温度对亚麻木酚素得率的影响见图5。结果表明，随着超声温度的增加，得率先增加后减小，在40℃达到最大值，45℃后亚麻木酚素得率趋于平缓，逐渐下降。原因是温度过高，亚麻籽粉中活性成分被破坏，而且杂质的溶出量会增加，所以木酚素得率会下降。因此超声温度的考查水平值定为40℃。

图5 提取温度对亚麻木酚素得率的影响

2.2.5 超声时间的影响

在超声功率400 W，液固比15∶1，提取温度40℃条件下，考察超声时间对亚麻木酚素得率的影响（见图6）。由图6可知，超声15 min时木酚素得率最高为6.9 mg／g。15 min后略有下降，可能是因为随超声处理时间延长，会有少量亚麻胶溶出，使得系统中黏度增加，阻碍木酚素溶出，而导致其得率下降。综合考虑考察指标和试验需求，超声时间考查水平值定为15 min。

图6 提取时间对亚麻木酚素得率的影响

2.3 响应面分析

2.3.1 试验设计及结果

在单因素试验的基础上，确定以颗粒度为60目的亚麻籽粉为原料，超声功率400 W条件下，分别以液固比、超声温度和超声时间为考察因素，以木酚素得率为试验指标，根据Box－Behnken中心组合设计原理，设计3因素3水平的响应面分析试验，试验设计及结果见表2。

表2 中心组合试验设计及结果

2.3.2 方差分析及二次回归模型的拟合

通过Design－Expert 8.0数据分析软件对试验结果进行分析，方差分析如表3所示。在一次项中，液固比X1对提取物得率的影响达到极显著水平（P ＜0．01），在二次项中，液固比X21、超声温度X22和超声时间X23均达到了极显著水平（P＜0.01），这表明3个因素与亚麻木酚素的得率有直接关系，是主要的限制因子，其较小的变化可引起得率相当大的改变。由于各因素对亚麻木酚素得率的影响不是简单的线性关系，为了更明确各因子对其的影响，因此采用软件对木酚素的得率进行二次回归模型拟合，回归方程如下：

方程的显著性分析得F＝9．485 319，相应的概率值P＜0.01，表明该方程模型极显著，不同处理间的差异高度显著。失拟项值为0.487 7没有达到显著水平，表明非试验因素对试验结果影响不大，说明该模型适合亚麻木酚素提取条件的筛选。

表3 回归模型的方差分析

2.3.3 提取工艺的响应面分析与优化

响应面图形是响应值Y对应于试验因素X1、X2、X3所构成的三维空间的曲面图，其可以直观的反映各因素及它们之间的交互作用对响应值的影响。由图7可以看出，亚麻木酚素得率同液固比与超声温度具有明显的二次抛物线关系，并且二者有明显的交互作用，在超声温度较低时，得率随液固比的增加而提高，随着温度的升高，增加幅度减小甚至下降，表明在不同温度下，液固比对得率的影响也不同；图8显示液固比与超声时间具有明显的交互作用，得率随超声时间的增加先增加后减小；图9显示在较小的超声温度下，得率随超声时间的延长而增大，在较大超声温度下，得率随时间的增加而减小。

图7 液固比和超声温度对亚麻木酚素得率的影响

图8 液固比和超声时间对亚麻木酚素得率的影响

图9 超声温度和超声时间对亚麻木酚素得率的影响

2.3.4 最佳工艺条件的确定及验证试验

由响应面图可知，当其中两个变量取最佳值，响应面的最高点在另一项的设计取值范围内，说明响应面各变量设计良好，可以求解响应值最高点。用Design－Expert 8.0软件中的Box－Benhnken模块对试验模型进行典型性分析，获得最优的提取工艺条件为：以颗粒度为60目的亚麻籽粉为原料，60%乙醇为提取溶剂，超声功率400 W，液固比16.94∶1，超声温度40.44℃，超声时间15.19 min，亚麻木酚素得率预测值为7.20%。考虑到实际操作的便利，确定亚麻木酚素的提取工艺条件为：液固比17∶1，超声温度40℃，超声时间15 min。为了验证响应面法的可行性，采用得到的最佳提取工艺进行亚麻木酚素提取试验，共进行3次重复，平均得率为（7.18±0.005）mg／g。结果表明，亚麻木酚素在优化后的得率与最大得率的预测值很接近，预测值与实测值之间具有良好的拟合性，充分验证了所建模型的有效性，说明回归方程能较真实地反映各因素对亚麻木酚素得率的影响。

表4 验证试验结果

2.4 亚麻木酚素抗氧化活性研究

IC50值常用来比较清除自由基能力的大小，IC50值越小，清除自由基的能力越强，表明其抗氧化能力就越强。从表5可以看出，亚麻木酚素对DPPH·、过氧化氢和超氧阴离子均有良好的清除能力，清除率随质量浓度增加而变化，且清除能力大于VC，这可能与它的结构中的酚羟基有关［15］。酚羟基易与自由基反应，形成大的共轭体系，使得自由基电子较为分散而比较稳定，从而使SDG表现出良好的抗氧化活性。

表5 亚麻木酚素抗氧化活性

3 结论

3.1 采用Box－Benhnken中心组合设计原理和响应面法，建立了亚麻木酚素提取工艺优化的数学回归模型，Y ＝7．12 ＋0．38X1＋0．18X2＋0．056X3－0．21X1X2－0．037X1X3＋0．012X2X3－0．46X21－0．602X2－0．57X23。方差分析表明，建立回归模型的“P＞F”值为0.003 6，小于0.01，表明该二次方程模型极显著，可以较准确地进行亚麻木酚素得率的预测。

3.2 亚麻木酚素超声波辅助提取最佳条件：以颗粒度为60目的亚麻籽粉为原料，60%乙醇为提取溶剂，超声功率400 W，液固比17∶1，超声温度40℃，超声时间15 min。在此条件下亚麻木酚素得率为7.18 mg／g，试验可为工业化提取亚麻木酚素提供一定的技术依据。

3.3 亚麻木酚素对DPPH、过氧化氢和超氧阴离子均有良好的清除能力，IC50值分别为145 mg／L、75 mg／L 和0.25 mg／L。

［1］张文斌，许时婴.亚麻木酚素的微波辅助提取工艺研究［J］.天然产物研究与开发，2006，18：286 －290

Zhang W B，Xu SY.Study on micro－wave－assisted extraction of flaxeedlignan［J］.Natural Product Research and Development，2006，18：286 －290

［2］赵利，党占海，李毅.亚麻木酚素研究进展［J］.中国农学通报，2006，22（4）：88 －93

Zhao L，Dang Z H，Li Y.Research progress on flaxlignan［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2006，22（4）：88 －93

［3］孙伟洁，杨宏志，钟运翠，等.超声波辅助提取亚麻木酚素的工艺研究［J］.中国粮油学报，2009，24（7）：124 －127

Sun W J，Yang H Z，Zhong Y C，et al.Condition optimization for ultrasonic—assistant extraction of lignan in flaxseeds［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2009，24（7）：124 －127

［4］Draganescu D，Ibanescu C，Tamba B I，et al.Flaxseed lignan wound healing formulation：Characterization and in vivo therapeutic evaluation［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2015，72（1）：614 －623

［5］李静，陈冬梅，陈明星.亚麻木酚素小鼠体内抗氧化活性研究［J］.中国粮油学报，2012，27（1）：48 －52

Li J，Chen D M，Chen M X.Study on the antioxidant activity of secoisolariciresinol diglusoside（SDG）in mice body［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2012，27（1）：48 －52

［6］杨宏志，李静，陈明星.开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（SDG）抗氧化活性研究［J］.中国食品学报，2012，12（8）：73－77

Yang H Z，Li J，Chen M X.Research on antioxidant activity of secoisolariciresinol diglusoside［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2012，12（8）：73 －77

［7］Lindahl G，Saarinen N，Abrahamsson A，et al.Tamoxifen，flaxseed，and the lignan enterolactone increase stroma － and cancer cell－derived IL－1Ra and decrease tumor angiogenesis in estrogen － dependent breast cancer［J］.Cancer Research，2011，71（1）：51 －60

［8］Prasad K.Suppression of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene expression by secoisolariciresinol diglucoside（SDG），a new antidiabetic agent［J］.International Journal of Angiology，2002，11：107 －109

［9］Gacace J E，Mazza G.Pressurized low polarity water extraction of lignans from whole flaxseed［J］.Journal of Food Engineering，2006，77：1087 －1095

［10］Zhang Z SH，Li D，Wang L J，et al.Optimization of ethanol－water extraction of lignans from flaxseed［J］.Separation Purification Technology，2007，57：17 －24

［11］崔宝玉，刘玉，阚侃，等.亚麻木酚素提取与纯化的研究进展［J］.食品研究与开发，2010，31（7）：181 －184

Cui B Y，Liu Y，Kan K，et al.Progress on extraction and separation of flax lignans［J］.Food Research and Development，2010，31（7）：181 －184

［12］郭雪峰，岳永德，汤锋，等.用清除有机自由基DPPH法评价竹叶提取物抗氧化能力［J］.光谱学与光谱分析，2008，28（7）：1578 －1582

Guo X F，Yue Y D，Tang F，et al.Detection of antioxidative capacity of bamboo leaf extract by scavenging organic free radical DPPH［J］.Spectroscopy and spectral analysis，2008，28（7）：1578 －1582

［13］刘大川，庞美霞，吴波.开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷抗氧化性能的研究［J］.中国油脂，2002，27（6）：37 －40

Liu D C，Pang M X，Wu B.Study on antioxidant activity of secoisolariciresinol diglusoside［J］.China Oils and Fats，2002，27（6）：37 －40

［14］郭雪峰，岳永德，汤锋，等.用清除超氧阴离子自由基法评价竹叶提取物抗氧化能力［J］.光谱学与光谱分析，2008，28（8）：1823 －1826

Guo X F，Yue Y D，Tang F，et al.Detection of antioxidative capacity of bamboo leaf extract by scavenging superoxide anion free radical［J］.Spectroscopy and spectral analysis，2008，28（8）：1823 －1826

［15］Wenk C.Herbs and botanicals as feed additives in monogastric animals［J］.Asian － Austra Jorunal of Animal Science，2003，16：282 －289.

Ultrasonic－Assisted Extraction Technology by Response Surface Methodology Optimization and Inoxidizability of Lignan in Flaxseeds

Li Huizhen Li Na Zhang Zhijun Li Xiaojun Chen Tie
（School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051）

With flaxseeds as raw material，the ultrasonic － assistant extraction of lignan in flaxseeds was studied.Through single － factor experiments，the effects of particle size，ultrasonic frequency，liquid to solid ratio，ultrasonic temperature and time on the yield of lignan in flaxseeds were investigated.On the basis of single－factor experiments，a quadratic polynomial regression equation of the forecasting model was set up by using Box－Behnken core combination design and process optimization of ultrasonic extraction of lignan in flaxseeds，The study results showed that the optimal process conditions of ultrasonic － assistant extraction of lignan in flaxseeds were as follows：particle size 60 mesh of raw materials，extraction solvent 60%ethanol，ultrasonic power 400 W，liquid to solid 17∶1，ultrasonic temperature 40 ℃ and ultrasonic time 15 min，the yield of lignan in flaxseeds was 7.18 mg／g.The antioxidant activity study showed that abilities of lignan in flaxseeds to scavenge DPPH and hydrogen peroxide and superoxide anion were good and IC50were 145 mg／L、75 mg／L and 0.25 mg／L respectively.

flaxseed，lignan，ultrasonic，response surface methodology，antioxidant activities

S565.9

A

1003－0174（2016）08－0062－07

山西省回国留学人员科研资助项目（2013－080）；山西省国际科技合作项目（2013081004）

2014－12－10

李会珍，女，1974年出生，副教授，植物提取与产品开发

张志军，男，1973年出生，教授，植物资源开发与利用