三裂鼠尾草素在CIK 细胞增殖及其胃癌细胞杀伤中的作用

王军生，吴克俭，刘军权，陈复兴，陈永强，周 燏，颜学兵

徐州医学院附属医院消化内科，江苏 徐州221006

胃癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，肿瘤过继细胞免疫治疗成为治疗胃癌的新途径之一，其主要是利用肿瘤患者的自身免疫细胞达到治疗的目的［1］。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cells，CIK)是一种重要的免疫效应细胞，具有抗肿瘤活性。但如何获得足够数量并具有高活性的CIK 细胞已成为治疗有效与否的关键［2］。三裂鼠尾草素(Salvigenin)有促进细胞凋亡、免疫调节功能，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性［3］。本实验通过观察三裂鼠尾草素对CIK 细胞增殖及对胃癌细胞SGC-7901 杀伤活性的影响，进而探讨其可能的机理。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂:人胃癌SGC-7901 细胞株(上海细胞研究所);PerCP-Cy 5.5 标记的CD3 抗体和FITC 标记的CD56 抗体、PE 标记的穿孔素(Perforin，PFP)、颗粒酶B(GranzymeB，GraB)和APC 标记的CD107a 抗体(杭州联科生物公司);IL-15 和IL-21(R＆D 公司);CD3 mAb(上海免疫研究所);CD28 mAb(苏州大学生物技术研究所);鼠抗人β-catetin、PERK1/2，兔抗人Bcl-2 和P-AKT 抗体(CST 公司)。

1.2 方法

1.2.1 CIK 细胞的培养:取健康者外周抗凝血100 ml，分离得到单个核细胞，调整细胞数为5 ×108/L，加入PPMI 1640 培养液，接种于6 孔细胞培养板，每孔5 μl，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后收集细胞，调整细胞数为5 ×108/L，用PPMI 1640 完全培养液接种于6 孔板，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2 d 换培养基(含IL-15、IL-21、CD28)1 次，采用FCM检测CIK 细胞表型CD3+CD56+表达。

1.2.2 CCK8 法检测三裂鼠尾草素对CIK 细胞生长的影响:收集培养10 d 的CIK 细胞，1 ×108/L 细胞数接种于96 孔板，200 μl/孔，加入三裂鼠尾草素［终浓度为0(空白对照组)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3、6、12.8、25.6、51.2、102.4、204.8、409.6、819.2、1 638.4 pmol/L］，孵育24、48、72 h 后，加入CCK8，孵育后，于酶标仪450 nm处检测各孔吸光值(OD)。

1.2. 3 FCM 检测三裂鼠尾草素对CIK 细胞中CD107a、GraB 和PFP 表达的影响:收集培养10 d CIK细胞分别接种于6 孔板，加入三裂鼠尾草素［终浓度分别为0(空白对照组)、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 pmol/L］，FCM 检测CD107a、GraB 和PFP 的含量。

1.2.4 LDH 释放法检测CIK 细胞杀伤活性:按已建立的LDH 释放法［4］进行检测。收集培养10 d 的CIK细胞，加入三裂鼠尾草素(终浓度分别为0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 pmol/L)，同时设FCM 检测CIK 细胞表型CD3+CD56+表达FCM 检测CIK 细胞表型CD3+CD56+表达，取胃癌SGC-7901 细胞株，使效应细胞和靶细胞比例为10∶1，按LDH 试剂盒说明书要求操作，在生化分析仪340 nm 处测定吸光度值(A)。

1.2.5 Western blotting:Western blotting 检测三裂鼠尾草素作用前后CIK 细胞β-catetin、P-ERK1/2 和PAKT 的表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0 软件进行单因素方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIK 细胞的培养 培养前，外调血单位核细胞(peripheral blood monouclear cells，PBMC)中CD3+CD56+T 细胞比例＜4%，培养10 d 后CD3+CD56+T细胞比例增至45.20%，与培养前比较，显微镜观察可见培养第10 天的CIK 细胞，细胞体积增大，呈圆形或椭圆形，包膜光滑，细胞数量增多，部分形成集落，FCM检测CIK 细胞表型CD3+CD56+表达如图1 所示。

2.2 CCK8 检测结果 相同浓度的三裂鼠尾草素作用后，48 h 时CIK 细胞增殖达最高峰，与24 h、72 h 组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05);与对照组比较，浓度为1.6 ～204.8 pmol/L 的三裂鼠尾草素诱导CIK细胞24 h、48 h、72 h 后，CIK 细胞增殖明显(P ＜0.05);三裂鼠尾草素浓度为409.2 ～1 638.4 pmol/L时，CIK 细胞增殖率为负值，与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图2)。

图1 CIK 细胞的培养:扩增前和扩增第10 天CIK 细胞FCM分析Fig 1 The cultivation of CIK cells:before the amplification and the FCM analysis of CIK cells on the tenth day

图2 三裂鼠尾草素对CIK 细胞增殖率的影响Fig 2 The effect of Salvigenin on the proliferation rate of CIK cells

2.3 FCM 检测结果 三裂鼠尾草素作用CIK 细胞48 h 后，CIK 细胞GraB、PFP 和CD107a 的表达不同程度升高，25.6 pmol/L 浓度组与对照组比较，差异均有统计学意义(P ＜0.05);各实验组中，25.6 pmol/L 组GraB、PFP 和CD107a 的表达最高，与其他浓度组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图3)。

2.4 杀伤活性检测结果 三裂鼠尾草素的浓度在1.6 ～25.6 pmol/L 作用CIK 细胞48 h 后，对胃癌细胞株的杀伤活性显著高于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05);浓度在25.6 pmol/L 时杀伤活性达最高峰，为96.75%，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图4)。

2.5 Western blotting 检测结果 三裂鼠尾草素作用CIK 细胞48 h 后，CIK 细胞β-catetin、P-ERK1/2、Bcl-2和P-AKT 的表达不同程度升高，在浓度为25.6 pmol/L时，β-catetin、P-ERK1/2、Bcl-2 和P-AKT 的表达均高于对照组(P ＜0.05，见图5 ～6)。

图3 三裂鼠尾草素作用48 h 后，CIK 细胞GraB、PFP、CD107a 表达的FCM 结果Fig 3 Expressions of Gra B，PFP，CD107a of CIK cells in FCM after 48 hours with Salvigenin effect

图4 三裂鼠尾草素作用CIK 细胞48 h 后，CIK 细胞对胃癌细胞株杀伤活性的影响;图5 三裂鼠尾草素作用CIK 细胞48 h 后的蛋白表达;图6 三裂鼠尾草素作用后CIK 细胞β-catenin、P-ERK1/2、Bcl-2 和P-AKT 灰度值比较Fig 4 Effect of CIK cells on the activity of gastric cnacer cell lines after 48 hours with Salvigenin effect;Fig 5 Expression of protein of CIK cells after 48 hours with Salvigenin effect;Fig 6 Comparsion of β-catenin，P-ERK1/2，Bcl-2 and P-AKT grey value after Salvigenin effect

3 讨论

CIK 细胞是同时表达CD3 和CD56 两种膜蛋白分子的免疫细胞，具有T 淋巴细胞的抗肿瘤活性和非主要组织相容性复合性(major histocompatibility complex，MHC)限制性杀瘤特点，是肿瘤过继细胞免疫治疗中的一种免疫效应细胞［5］。CIK 细胞增殖速度快，具有杀瘤活性与杀瘤谱广特点，目前CIK 细胞已应用于多种肿瘤的治疗［6］。三裂鼠尾草是天然多酚类化合物，属于黄酮类类似物，Noori 等［3］研究发现三裂鼠尾草素对荷瘤小鼠作用后抑制肿瘤生长速率，肿瘤体积变小，调节免疫反应，提高抗肿瘤效力。Rafatian 等［7］研究发现在氧化应激诱导人成神经细胞瘤SH-SY5Y 细胞的细胞凋亡和自噬过程中，三裂鼠尾草素可通过细胞凋亡蛋白酶途径的独立抗氧化活性，促进细胞凋亡和自噬活动的增强。本研究通过不同浓度三裂鼠尾草素在体外诱导人CIK 细胞，发现在三裂鼠尾草素浓度为1.6 ～204.8 pmol/L 时，可明显促进CIK 细胞增殖，浓度为25.6 pmol/L 时，CIK 细胞增殖率达最大值，当三裂鼠尾草素浓度超过819.2 ～1 638.4 pmol/L，CIK 细胞增殖出现明显抑制，这一效应呈现较明显剂量依赖关系，提示三裂鼠尾草素对CIK 细胞的增殖作用有浓度窗现象。

PFP 和GraB 均可存在于活化的CTL 和NK 细胞胞质颗粒中，其介导的细胞毒途径是CTL 和NK 细胞抗肿瘤的主要方式之一［8］。PFP 释放后当Ca2+存在时，在靶细胞上聚合形成活性孔道，在靶细胞膜内外形成明显的渗透压反差，导致靶细胞胀裂而死，GraB 也可以通过此PFP 形成孔道进入靶细胞，诱导靶细胞凋亡［9-10］。T 细胞表面的CD107a 分子，与T 细胞活化以后脱颗粒过程相关，其比值可以直接反应该效应细胞具有的特异性杀伤活性［11-12］。本实验中发现三裂鼠尾草素能够促进CIK 细胞GraB、PFP 和CD107a 的表达，从而增强了CIK 细胞对胃癌细胞的杀伤活性。

β-catenin 的活化可激活Erk 分子，进而上调Bcl-2的表达，促进免疫细胞的存活，从而控制自身免疫应答反应［13］。Bcl-2 蛋白家族直接调节线粒体膜的渗透性从而调节细胞色素C，发挥抗凋亡和促凋亡的作用［14］。本实验发现三裂鼠尾草素可促进CIK 细胞βcatetin、ERK1/2、Bcl-2 和P-AKT 的表达，三裂鼠尾草素在浓度为1.6 ～25.6 pmol/L 时随着浓度的提高而增强CIK 细胞Bcl-2 的表达，且对CIK 细胞的增殖及杀伤活性均有明显的促进作用。因此可以推断，三裂鼠尾草素对CIK 细胞的增殖及对肿瘤细胞的杀伤作用与激活β-catetin、ERK1/2 和Bcl-2 信号通路的表达密切相关，在上述各信号通路中是否具有共同的调节靶点亟待进一步研究。本实验中CIK 细胞的AKT 表达也上调，三裂鼠尾草素可能还通过PI3K/AKT 信号传导通路进一步影响T 细胞的增殖、分化，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。

综上所述，三裂鼠尾草素能够促进CIK 细胞的增殖，从而有效提高CIK 细胞对胃癌细胞的杀伤活性，其机制可能与三裂鼠尾草素激活β-catetin、ERK1/2、Bcl-2、P-AKT 信号通路，上调CIK 细胞中GraB、PFP、CD107a 的表达有关。以上实验结果为三裂鼠尾草素用于肿瘤的免疫治疗提供了实验依据，也为草药单体在免疫细胞的培养应用中提供实例。

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