一对2型糖尿病老年双生子基因表达谱动态变化比较

一对2型糖尿病老年双生子基因表达谱动态变化比较

谭从娥冯文哲1王米渠2

(陕西中医学院中医诊断学教研室，陕西咸阳712046)

摘要〔〕目的分析一对老年同卵双生子2型糖尿病(T2DM)随病程延长而稳定表达的基因功能特征。方法连续2年分6次调查一对老年双生子的T2DM病情变化并作基因芯片实验，筛选出表达量随病程延长而连续升高的基因为双生子的共表达基因，通过FatiGO Compare工具比较两组共表达基因功能注释的异同。结果分别筛选到大、小双的共表达基因473和529个，其中相同的共表达基因功能富集于“T细胞活化调节” 基因本体(GO)类，不同的共表达基因功能差异体现在分子功能调节及刺激反应2个GO类别。结论免疫功能基因的异常表达是该对双生子T2DM随病程延长而稳定出现的共性特征。

关键词〔〕2型糖尿病；同卵双生子；共表达基因；基因表达谱

中图分类号〔〕R587.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81473559)；陕西省自然科学基础研究计划(No.2011JM4024)

1陕西中医学院附属医院2成都中医药大学基础医学院

第一作者：谭从娥(1972-)，女，副教授，博士，主要从事证侯的分子调控机制研究。

同卵双生子间一致的表征可认为与遗传因素有关，不一致的表征则大多数与环境因素有关〔1〕。基因的表达会受到时空因素的影响，不同的外在环境会导致基因的表达量不同，本研究分析2型糖尿病(T2DM)同卵双生子功能基因表达的异同，探讨双生子T2DM随时间延长而稳定表达的功能基因特征。

1对象与方法

1.1对象双生子，女性，69岁，均出生并居住于四川省成都市。根据世界卫生组织1999颁布的糖尿病诊断标准，双生子均为T2DM患者。大双病史7年，小双病史9年。理化检查提示大、小双目前无明显的糖尿病并发症。采用微卫星DNA基因分型技术〔2，3〕鉴定双生子卵型(同卵或异卵)，结果双生子的15个基因座完全相同，说明这对双生子为同卵双生子。实验前均签署知情同意书。

1.2理化检查于2011年1月至2012年8月内，每4个月一次完成双生子T2DM患者全身体检，每年3次，共6次。双生子体检于成都中医药大学附属医院体检中心完成，项目包括一般情况、物理检测、生化常规及糖化血红蛋白等内容。每次采取外周血以备完成基因芯片实验。

1.3基因芯片实验方法以大双和小双为实验组，以大双的女儿为正常对照，每4个月一次共6次采取双生子外周血，基因芯片实验于上海生物芯片有限公司完成。实验流程：取实验组和正常对照每人外周血10 ml，提取总RNA，反转录为cDNA，采用上海生物芯片有限公司制备的cDNA人类全基因组表达谱芯片，实验组和对照分别用cy3和cy5标记，进行基因芯片杂交。芯片用ScanArray Express双通道激光扫描仪(Packard Bioscience公司)扫描，软件读取数据，采用Genespring进行Normalize处理分析，最后ratio值为实验/对照。

1.4基因芯片数据分析共表达基因的筛选标准为6次检测的差异基因中表达量连续升高的基因。采用FatiGO Compare数据库实现双生子之间共表达基因的GO和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路注释比较。

1.5统计学分析组间比较行Fisher精确检验。

2结果

2.1双生子实验室检测结果双生子但T2DM病情的轻重程度差异较大，小双重于大双。大双糖化血红蛋白值介于6.0%～8.0%之间，血糖控制较为理想，小双糖化血红蛋白值在8.0%～9.0%之间，说明对血糖的控制较差。小双的甘油三酯轻度升高，而且在2011年5月的体检中发现血尿素氮(BUN)增高，大双在3次体检中这两项指标正常，提示大双和小双目前均无严重的肝肾功能损害。见表1。

2.2双生子共表达基因筛选结果根据共表达基因的筛选标准得到大双共表达基因473个，小双共表达基因529个，两组共表达基因中相同的为15个，大电导钙激活钾通道，M亚族β链成员4(KCNM)、Lysosomal相关的膜蛋白(LAMP)3、白介素(IL)-18、核孔蛋白210 kD(NUP210)、IL-12A、聚合酶(POLE4)、IL-1R1、环指蛋白(RNF)122、干扰素调节因子(IRF)4、溶质携带物家族38，成员(SLC38A)1、载脂蛋白L域含1(APOLD1)、早期反应(IER)5、人白细胞抗原(HLA-DPA)1、赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶(KDM)3A、人鸟苷酸核苷酸结合蛋白(GBP)4。

表1双生子3年血生化及糖化血红蛋白检查结果(大双/小双)

2010-6-252011-6-72012-4-26空腹血糖7.35/13.68.09/13.7217.8/18.40餐后2h血糖9.90/16.7211.26/13.4210.54/18.74甘油三酯1.38/2.251.36/3.541.12/2.74血尿素氮(mmol/L)4.33/5.423.91/8.165.12/6.46糖化血红蛋白(%)6.90/8.607.60/9.507.60/8.90

2.2.1双生子相同的共表达基因功能注释将相同的15个基因输入FuncAssociate芯片数据网络分析平台，结果基因功能注释只有1个显著性GO类(P<0.05)，即T细胞活化的调节，有3个基因(IL-18、IL-12A、IRF4)被注释到该GO术语。KEGG通路注释发现，15个基因被注释到19条分子通路，其中细胞因子-细胞因子受体相互作用通路具有显著性，3个基因IL-18、IL-12A、IL-1R1在该通路中得到注释。

2.2.2双生子不同共表达基因的功能注释比较将双生子共表达基因输入FatiGO Compare数据库进行基因功能注释比较，移去两组基因中相同的基因，大双473个共表达基因中有321个基因获得注释，小双529个共表达基因中有206个基因获得注释。在GO生物学过程、分子功能及细胞成分3个层次，分别有2、3和3个GO术语在双生子间有显著性差异(P<0.05)，见表2。在KEGG通路注释比较差异没有显著性(P>0.05)。

表2双生子不同共表达基因功能注释比较〔n(%)〕

GO术语GO类别/水平小双基因数目大双基因数目P值分子功能调节(GO:0065009)生物学过程/35(29.2)0(71.8)0.01生物刺激反应(GO:0009607)生物学过程/30(0)8(100)0.02RNA结合(GO:0003723)分子功能/42(18.4)13(81.6)0.03核糖核蛋白复合体(GO:0030529)细胞成分/60(0)7(100)0.04

3讨论

T2DM是由遗传和环境因素共同作用所形成的复杂疾病。研究〔4，5〕表明，T2DM在同卵双生子中具有高度的患病一致性，但是即便是同卵双生子，T2DM的患病仍然具有差异性和非同步性的特点，具体表现为发病时间的不一致性、病情轻重程度的差异性以及并发症出现的不同性等。本研究选择的双生子姐妹为同卵双胞胎，虽然都确诊患T2DM，但二者病程、轻重程度及兼症等都有很大的不同。和大双相比，小双T2DM发病时间早、病情程度重，在连续2年的6个观测点上，空腹血糖值均明显高于大双，血糖控制不理想。随着病程的延长，二者的病情程度均有加重，但是加剧的程度不一致，小双出现肾功的轻度损伤。说明同卵双生子虽然遗传基础相同，所患疾病名称相同，但是疾病的具体表现形式仍存在很大的差异。 通过对双生子连续2年6个时间点基因表达谱数据的综合分析，筛选出了大双和小双跟病情发展相关的共表达基因473和529个。这些共表达基因的表达量均随着病程的延长而逐渐增加，因此可认为这些基因和T2DM的病情加剧密切相关。双生子两组共表达基因中有15条相同的基因，GO功能注释“T细胞活化调节”出现显著性。T细胞在特异性免疫应答中起关键性作用，不仅负责细胞免疫，对体液免疫也起重要的辅助和调节作用〔6〕，而且在老年T2DM患者中，T细胞亚群数量和各亚群之间的比例和患者的血糖水平明显相关〔7〕，提示免疫功能紊乱是这对双生子T2DM随病程延长而稳定出现的共性特征。双生子之间不同的共表达基因在多个GO术语得到注释，这些术语中有显著性差异的GO主要为分子功能调节和生命刺激两类，说明同卵双生子T2DM患病分子基础的差异性，差异的形成主要与双生子间的个体因素及生活环境的不同有关，值得深入研究。

本研究发现这对老年双生子T2DM患病分子基础既存在共性又存在差异，共性特征是都存在免疫功能的异常，差异性主要体现在二者分子功能调节及刺激反应等方面的调节不同。

4参考文献

1Bogdanos DP，Smyk DS，Rigopoulou EI,etal.Twin studies in autoimmune disease：genetics，gender and environment〔J〕.J Autoimmun，2012；38(2-3):156-69.

2Jackson RW，Snieder H，Davis H,etal.Determination of twin zygosity：a comparison of DNA with various questionnaire indices〔J〕.Twin Res，2001；4(1):12-8.

3Hamosh A，Scott AF，Amberger JS,etal.Online mendelian inheritance in man (OMIM)，a knowledge base of human genes and genetic disorders〔J〕. Nucleic Acids Res，2005；33(1)：52-5.

4Scherrer JF，Xian H，Lustman PJ,etal.A test for common genetic and environmental vulnerability to depression and diabetes〔J〕.Twin Res Hum Genet，2011；14(2):169-72.

5Poulsen P，Grunnet LG，Pilgaard K,etal.Increased risk of type 2 diabetes in elderly twins〔J〕.Diabetes，2009；58(6):1350-5.

6孙汶生,王福庆.医学免疫学〔M〕.北京:高等教育出版社,2006:141-5.

7符琳琳,张消克.老年2型糖尿病患者细胞免疫状态及T细胞亚群的观察〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(11)：2099-100.

〔2013-09-12修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)