安神补脑软胶囊对老年失眠模型大鼠下丘脑5-羟色胺1a、5-羟色胺2a、γ-氨基丁酸表达量的影响

安神补脑软胶囊对老年失眠模型大鼠下丘脑5-羟色胺1a、5-羟色胺2a、γ-氨基丁酸表达量的影响

王冰梅于江波王永彬陆韬吴迪于智莘

(长春中医药大学，吉林长春130117)

摘要〔〕目的观察安神补脑软胶囊对失眠大鼠下丘脑5-羟色胺(5-HT)1a、5-HT2a、γ-氨基丁酸(GABA)含量的影响。方法采用腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)法造模。造模成功后，随机将动物分为老年模型组(模型组)、安神补脑软胶囊高中低组(安神高中低组)、地西泮组；另设青年对照组(对照组)。分别给予安神补脑软胶囊(24、12、6 g生药/kg)、地西泮(0.525 mg/kg)，对照组、模型组给予相应容量的蒸馏水，连续给药7 d，荧光定量PCR检测下丘脑内5-HT1a、5-HT2a受体mRNA的表达，酶联免疫法、免疫组化法检测GABA含量。结果与模型组相比，各给药组下丘脑5-HT1a表达量明显升高，5-HT2a表达量明显降低，GABA蛋白的表达明显增多(均P<0.05)。结论安神补脑软胶囊通过调节失眠模型大鼠下丘脑中5-HT1a、5-HT2a、GABA的表达发挥治疗作用。

关键词〔〕安神补脑软胶囊；失眠；5-羟色胺1a；5-HT2a；γ-氨基丁酸

中图分类号〔〕R749〔文献标识码〕A〔

基金项目：2013年度吉林省博士后科研项目启动经费项目

通讯作者：于智莘(1977-)，女，博士，副教授，主要从事药物制剂研究。

1吉林敖东药业集团有限公司博士后科研工作站

于江波(1965-)，男，研究员，主要从事药学、制药方面研究。

第一作者：王冰梅(1970-)，女，博士，在站博士后，副教授，主要从事中药药理学研究。

安神补脑液用于神经衰弱、失眠、健忘、头晕、乏力等症，临床上疗效显著〔1〕。动物实验结果表明，安神补脑液可明显改善动物的睡眠质量〔2〕；对记忆再现障碍有明显的改善作用〔3〕。我们在不改变其原有提取工艺和服用剂量的前提下，将其改成软胶囊剂，解决了其口服液制剂含糖、防腐剂以及成品运输携带不便等缺点。本文观察安神补脑软胶囊对睡眠剥夺老年大鼠下丘脑白细胞介素(IL)-1β、γ-氨基丁酸(GABA)含量的影响，旨在证实安神补脑软胶囊的疗效及其作用机制。

1材料和方法

1.1试剂及药物对氯苯丙氨酸(PCPA)(Sigma公司)，Trizol总RNA提取试剂盒(上海生工)，TransScript Green Two-Step q RT-PCR SuperMix试剂盒(北京全式金)；PCR引物合成(上海生工)；安神补脑软胶囊(吉林敖东延边药业股份有限公司)，地西泮(江苏济川制药有限公司)。

1.2实验方法雄性Wistar大鼠，分为青年对照组、老年实验组，其中对照组10只，实验组若干只。实验组动物以300 mg/kg剂量腹腔注射PCPA，连续给药2 d；对照组注射生理盐水。于第1次注射PCPA 48 h后应用阈剂量戊巴比妥钠(40 mg/kg)睡眠实验，以大鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间为指标，评价造模成功与否。取模型制备成功的实验组大鼠50只，随机分为模型组、地西泮(0.6 mg/kg)组、安神补脑软胶囊高、中、低(24、12、6 g生药/kg)组，每组10只。各给药组每日口服给药，对照组及模型组每日灌以生理盐水，连续给药7 d。

1.3实时荧光定量PCR检测下丘脑5-HT1a、5-HT2a受体mRNA的表达实验结束后，于末次药后2 h，各组动物在冰台上断头取脑，液氮速冻，-80℃冰箱保存。采用Trizol总RNA提取试剂盒提取各组动物下丘脑总RNA；TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒将总RNA逆转录成cDNA后测定下丘脑中的5-HT1a、5-HT2a受体mRNA的表达量。以GAPDH作内参，采用2-ΔΔCt法分析大鼠下丘脑5-HT1a、5-HT2a受体的基因相对表达量：循环阈值(ΔCt)=Ct样品均值-Ct内参均值，ΔΔCt=ΔCt-(Ct阴性对照样品均值-Ct内参均值)。

荧光定量PCR引物：GAPDH上游：5'-acatgccgcctggagaaacct-3'，下游：5'-gcccaggatgccctttagtgg-3'；5-HT1a上游：5'-ccgcacgcttccgaatcc-3'，下游：5'-tgtccgttcaggctcttcttg-3'；5-HT2a上游：5'-aacggtccatccacagag-3'，下游5'-aacaggaagaacacgatgc-3'。扩增条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，共40个循环。

1.4酶联免疫法检测下丘脑GABA含量取各组动物的下丘脑，冰浴中用匀浆器将标本充分匀浆，3 000 r/min离心20 min，收集上清。严格按试剂盒说明书进行操作，检测下丘脑中GABA的含量。

1.5免疫组织化学SABC法检测下丘脑GABA的表达按试剂盒说明书操作，GABA多克隆抗体(1∶200)，4℃过夜，DAB显色。GABA阳性细胞呈棕黄色。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件在400倍视野下选取相应区域4个不重叠视野，检测阳性染色部位的积分光密度(IOD)值。按平均IOD=IOD/面积计算，重复6次取其均值表示GABA的相对表达量。

1.6统计学方法采用SPSS15.0软件进行方差分析、t检验。

2结果

2.1安神补脑软胶囊对老年失眠模型大鼠下丘脑5-HT1a、5-HT2a mRNA表达量与模型组比较，各给药组下丘脑5-HT1a mRNA表达水平明显升高(P<0.01，P<0.05)；5-HT2a mRNA表达水平明显降低(P<0.01，P<0.05)，见表1。

2.2安神补脑软胶囊对老年失眠模型大鼠下丘脑GABA含量的影响与模型组〔(4.38±1.92)μg/g〕比较，各给药组GABA含量明显增加(P<0.05)，且具剂量依赖性。其中安神高组(10.27±2.45)μg/g，安神中组(9.16±2.10)μg/g，安神低组(7.18±1.48)μg/g，地西泮组(12.16±3.03)μg/g，对照组(15.84±2.46)μg/g。

2.3安神补脑软胶囊对老年失眠模型大鼠下丘脑GABA阳性细胞表达量的影响与模型组(90.78±18.18)相比，各给药组大鼠下丘脑GABA 阳性细胞染色较深，表达量也明显增多，其中安神高组GABA灰度值为(173.56±34.16)，安神中组为(163.51±32.68)，安神低组(131.83±27.44)，地西泮组为(175.89±35.24)，对照组为213.21±25.04。半定量评分结果表明，各给药组GABA表达较模型组明显增强(P<0.05)。见图1。

表1　各组下丘脑5-HT1a、5-HT2a mRNA

与模型组比较：1)P<0.05,2)P<0.01

图1　各组大鼠下丘脑GABA免疫组化染色比较(×200)

3讨论

睡眠是机体必不可少的生理过程，也是促进机体体力恢复及生长发育的重要过程，长期的睡眠不足或睡眠障碍，而老年人由于各种原因，常出现不同程度的睡眠障碍，在临床上发病率较高。而在治疗失眠的中药制剂中，安神补脑软胶囊多年来临床应用取得了良好的疗效。下丘脑前部存在着睡眠中枢，下丘脑后部有唤醒中枢，当睡眠中枢受到抑制而唤醒中枢兴奋性不足时，则发生丘脑-皮质投射神经元去极化，引起持续唤醒，从而导致睡眠障碍。与之兴奋性改变相关有着多种单胺类递质，可引起睡眠和唤醒交替进行。

王慧等〔4〕实验证明，酸枣仁汤能减少失眠模型大鼠中缝背核星形胶质细胞及小胶质细胞的激活，改善神经细胞损伤程度；张林挺等〔5〕证明酸枣仁汤可以降低大鼠脑内c-fos和c-jun基因的表达来治疗失眠。朱蕾等〔6〕证实刺五加可能是通过调节失眠引起的单胺类神经递质紊乱、加速5-HT 的代谢转化、调节NE 的异常、提高海马组织中AchE活性来影响睡眠的。

5-HT神经元广泛分布于中枢神经系统，在触发和维持睡眠中起重要作用。5-HT合成抑制剂PCPA可拮抗5-HT前体(5HTP)引起失眠，腹腔注射PCPA 引起的大鼠失眠是公认的动物失眠模型。在已知的5-HT的7个受体中，与抗失眠研究相关性最高的是5-HT1a和5-HT2a受体。5HT1a受体激动药具有减少快速动眼睡眠(REM)、增加REM潜伏期、升高脑内5HT含量的作用〔7〕，这可能是5HT1a受体激动药可以用于治疗失眠的机制之一。而研究表明〔8〕，5-HT2a受体拮抗剂可增加慢波睡眠(SWS)和非快速动眼睡眠(NREM)，减少觉醒次数且无对于REM的影响，因此认为5-HT2a受体拮抗药物是治疗失眠的比较理想药物。本研究提示其可能是通过影响下丘脑内5-HT1a、5-HT2a受体表达调节下丘脑内5-HT能系统的作用，从而起到治疗失眠的作用。

GABA是存在于中神经系统的抑制性氨基酸类递质，对睡眠的调节有着重要的影响。本研究提示，安神补脑软胶囊能够提高失眠模型大鼠下丘脑GABA含量及其在神经元内的表达，对失眠模型大鼠下丘脑GABA神经递质的表达有促进作用，且呈现量效关系，可以通过激活脑内抑制性单胺类神经递质，增加中枢对睡眠中枢的控制从而起到治疗失眠的作用。

4参考文献

1马岳青.安神补脑液治疗神经衰弱184例〔J〕.吉林中医药，1998；18(1):62.

2魏海峰，叶翠飞，李春阳，等.安神补脑液对睡眠剥夺模型大鼠学习记忆及脑源性神经营养因子表达的影响〔J〕.中国临床药理学与治疗学，2006;11(11):1230-3.

3温富春,许家洁,王玉红,等.安神补脑液对未成年小鼠学习记忆功能及脑内单胺类神经递质含量的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2007;13(2):46-8.

4王慧，罗坤，武静.酸枣仁汤对失眠大鼠中脑中缝背核神经胶质细胞的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012;18(21)：235-9.

5张林挺，李裕和.酸枣仁汤对失眠大鼠大脑c-fos及c-jun含量的影响〔J〕.陕西中医，2009;30(7)：928-9.

6朱蕾，张茹，李廷利.刺五加对睡眠剥夺大鼠学习记忆及海马单胺类神经递质的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012;18(4)：219-23.

7Sue J,Wilson A,Jayne E,etal.The use of sleep measures to compare a new 5HT1A agonist with buspirone in humans 〔J〕.Nutt J Psychopharmacol,2005;19(6):609-13.

8Fish LR,Gilligan MT,Humphries AC,etal.4-Fluorosulfonylpiperidines:selective 5-HT2A ligands for the treatment of insomnia 〔J〕.Bioorg Med Chem Lett,2005;15(16):3665-9.

〔2015-03-18修回〕

(编辑李相军/滕欣航)