右归丸及其拆方干预对老年肾阳虚证患者基因差异表达的影响

·基础研究·

右归丸及其拆方干预对老年肾阳虚证患者基因差异表达的影响

唐杨1，2项磊1周卫东1孙晓敏刘艳艳3罗仁1赵晓山

(南方医科大学中医药学院，广东广州510515)

摘要〔〕目的观察右归丸及其拆方对老年肾阳虚证患者基因差异表达的影响。方法选取年龄在60岁以上的肾阳虚证患者8例进入研究，按随机数字法将其分为两组(右归丸组及温肾阳组各4例)，另将4例60岁以下健康人设为正常对照组。分别观察治疗前及疗程结束后两组临床症状总积分，比较外周血白细胞的6条基因(SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B)的差异表达，并以GAPDH作为内参对照。结果右归丸组及温肾阳组连续用药2个疗程后，症状总积分在治疗前后均有统计学差异(t右归丸=20.657，P<0.01，t温肾阳=51.000，P<0.01)；治疗后两组间总积分比较有统计学差异(F=74.432，P<0.01)。RT-PCR结果显示，SYPL1基因，在右归丸组和温肾阳组的表达水平均存在统计学差异(t左归丸=-35.631，t温肾阳=-13.000，P<0.01)，且治疗后右归丸组和温肾阳组的表达均较治疗前上升。治疗后各组的SYPL1基因表达存在差异(F=487.049，P<0.01)，温肾阳组表达上升程度不及右归丸组。其他5种基因的表达情况与SYPL1基因状况类似。结论(1)右归丸及温肾阳中药复方对老年肾阳虚患者的基因差异表达均有改善作用，右归丸优于单纯温肾阳复方治疗效果，验证了阴中求阳法的优越性。(2)老年肾阳虚患者的基因表达在短期内不能单独依靠药物恢复至完全正常，需要一个长期和综合的治疗过程。

关键词〔〕右归丸；肾阳虚证

中图分类号〔〕R2-03〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(81173146，81202622)；NSFC-广东联合基金重点项目(No.U1132001)；广东省科技厅与广东省中医药科学院联合基金资助项目(No.2011B032200004，2013A032500008)；广东省科技计划(No.2011B031700018)；广州市科技计划(2014Y2-00504)资助

通讯作者：赵晓山(1975-)，男，副主任医师，研究员，主要从事常见慢性病的中西医结合防治研究。

1南方医科大学南方医院中医科2赣南医学院第一附属医院中医科

3广州中医药大学第一附属医院风湿科

罗仁(1952-)，男，博士生导师，教授，副主任医师，主要从事肾病肾虚证的中医药防治研究。

第一作者：唐杨(1982-)，女，主治中医师，在职博士，主要从事肾虚证的防治研究。

Significance of differential gene expression in kidney-yang deficiency syndrome treated by Yougui pill and its decomposed formula

TANG Yang, XIANG Lei, ZHOU Wei-Dong,etal.

School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515,Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo observe the differential gene expression in kidney-yang deficiency syndrome treated by Yougui pill.Methods8 patients above 60 years old with kidney-yang deficiency syndrome were included. The patients were randomly divided into Yougui pill treatment and nourishing Yang control group(n=4), another 4 healthy people under the age of 60 were set as normal control group. Each patient took the medicine for 4 weeks. The differential gene expressions for 6 genes(SYPL1,PHF14 ,ARHGAP18,RECQL,OSTF1 and SEC23B) pretherapy and post-treatment were observed respectively.ResultsAfter one course of treatment, the symptom integral had statistically significant difference within the treatment and control groups pretherapy and post-treatment(tt=20.657,P<0.01;tc=51.000，P<0.01),and the treatment group was superior to control groups in relieved the symptoms of kidney-yang deficiency syndrome(F=74.432，P<0.01); RT-PCR showed the difference of expression level of gene SYPL1 in Yougui pill group and nourishing Yang was statistically significant(P<0.01)pretherapy and post-treatment,both of the expressions of SYPL1 in two groups were increased than those of pretherapy.There were differences of gene expressions among every groups post-treatment(F=487.049,P<0.01). The other 5 genes' expressions were similar to that of SYPL1.ConclusionsThe gene expression in elderly patients with kidney-yang deficiency can not rely on medicaments to completely return to normal alone in the short term, which need a long-term and comprehensive treatment process.

【Key words】Yougui pill; Kidney-yang deficiency

中医学认为人衰老与肾密切相关。肾阳为肾中精气属阳的部分，具有温煦、升腾、推动、兴奋和气化等属性。人体阳气不足时，机体会出现畏寒肢冷，面色晄白，小便清长、下得清谷、舌质淡苔白，脉沉迟等肾阳虚证的症状。老年人肾虚发生率为78.80%，其中肾阳虚证占肾虚总数的5.70%，且呈增龄性增加〔1〕。右归丸为明代张景岳所创，以“阴中求阳”治法来治疗肾阳虚证，在理论上与单纯的温阳治法相比更具特色及科学性。本课题组既往的研究表明〔2〕，肾阴虚证和肾阳虚证与正常对照比较外周血白细胞中存在6条共同差异表达下调的基因SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B，这些可能是肾虚证表达下调的相关基因，但其机制尚未完全阐明。本研究旨在通过RT-PCR法观察经右归丸及其拆方对老年肾阳虚证患者治疗前后相关基因差异表达的变化。

1对象与方法

1.1研究对象按实验分组要求收集赣南医学院第一附属医院及南方医科大学南方医院2012年9月至2014年7月间诊治病人。纳入标准：采用病证结合手段，选取年龄在60岁以上，患慢性肾炎的肾阳虚证患者作为研究对象。排除标准：不符合纳入标准者；处于心脑血管、肿瘤、尿毒症等重大疾病的终末期；不愿接受研究者。

1.2肾阳虚证的辨证标准根据被调查者填写的量表内容和现场调查医师通过中医四诊掌握的资料，按《中医诊断学》〔3〕、1986年全国虚证与老年病会议制定的《中医虚证辨证参考标准》〔4〕，有关肾虚证的辨证标准、国家中医药管理局颁布《中医病证诊断疗效标准》等有关肾阳虚证的诊断标准。主症：腰膝酸软，性欲减退，畏寒肢冷；次症：精神萎靡，夜尿频多，下肢浮肿，动则气促，发槁齿摇，舌质淡苔白，脉沉迟，尺无力。诊断：具备以上主症2项、次症2项，即可确诊。症状积分按肾阳虚证每项证候的轻、中、重程度分级量化为1分、2分、3分，症状总积分为主症各项证候积分和次症各项积分的总和。

1.3分组共纳入符合条件的8例老年肾阳虚患者进入研究，男5例，女3例，年龄(62±1.13)岁，按随机数字法将其分为两组，右归丸组及温肾阳组各4例。另将4例60岁以下健康人设为正常对照组，男2例，女2例，年龄(55±2.72)岁。按照中医理论“阴中求阳”法，给予右归丸及其拆方治疗进行肾阳虚证研究：右归丸治疗组，给予右归丸(由熟地、山药、山茱萸、枸杞、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归、肉桂、制附子组成)免煎颗粒剂，每日2次，开水冲服；温肾阳对照组，给予右归丸之温肾阳中药复方(由鹿角胶、菟丝子、杜仲、肉桂、制附子组成)免煎颗粒剂，每日2次，开水冲服。4 w为1个疗程，每例患者连续用药2个疗程，分别观察治疗前及疗程结束后外周血白细胞的6条基因(SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B)的差异表达，并以GAPDH作为内参对照〔5〕。

1.4实验试剂与仪器设备DNA抽提试剂及Trizol试剂，RNA抽提试剂，均为美国MRC公司产品；RNA Later 保存液，Ambion公司；实时定量PCR试剂，Takara公司；其余实验所需常规化学试剂均来自广州化学试剂一厂及北京博奥生物公司；实时荧光定量PCR仪ABI7500FAST，ABI公司；FeroTec Gradien PCR 基因扩增仪，北京市化学仪器厂。

1.5方法

1.5.1两组治疗前后症状总积分比较右归丸组及温肾阳组连续用药1个疗程后，观察两组治疗前后的症状总积分变化。

1.5.2总RNA的提取和质检采集研究对象晨起空腹抗凝外周静脉血5 ml，参照Ambion公司RiboPureTM-Blood Kit的操作步骤制备白细胞；按操作规范提取样品总RNA后，通过核酸定量仪判断RNA质量，结果显示RNA完整性较好，可以进行下一步骤。

1.5.3荧光实时定量PCR检测利用GenBank查询基因的碱基序列，采用引物设计软件Primer 3.0。实时定量PCR测定的肾阳虚证6条基因及内参基因GAPDH引物见表1。

表1　肾阳虚证差异表达下调的6条基因及

cDNA模板制备(逆转录酶，RT)：在EP管中加入1 μl RNA、0.5 μl RNA酶抑制剂，0.5 μl Oligo、1 μl Rnase抑制剂，2 μl dNTPs，2 μl 5×Buffer，3 μl DEPC-H2O，将上述溶液混匀、离心，42℃水浴60 min，99℃5 min，冰上冷却，-20℃保存，进行实时PCR，配置相应的RT-PCR反应体系：2倍master mix(IQ SYBR GRN SUPERMX)10.0 μl，PCR引物各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，无菌水 8.0 μl。

将配置完毕的PCR反应液放置于荧光定量PCR仪上，反应条件：变性95℃ 3 min；然后95℃ 10 s，退火55℃ 10 s；延伸72℃，30 s，共反应39个循环。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统拍照成像，目的基因的表达水平用其与GAPDH的相对平均灰度值表示〔6〕。

1.6统计学处理采用SPSS13.0软件，组内比较采用配对设计资料的t检验，两组间比较使用方差分析、协方差分析、单因素方差分析(One-Way ANOVA)，有统计学意义再行LSD法多重比较。

2结果

2.1两组治疗前后症状总积分比较结果治疗前两组总积分比较无显著性差异(右归丸组25.50±3.51，温肾阳组24.75±3.40,F=1.149，P>0.05)；两组总积分在治疗前后均有统计学差异(t右归丸=20.657，P<0.01；t温肾阳=51.000，P<0.01)，治疗后两组比较差异有统计学意义(右归丸组8.50±1.29，温肾阳组16.00±2.16,F=74.432，P<0.01)。

2.2肾阳虚证三组治疗前后基因表达情况治疗前后SYPL1基因，在右归丸组和温肾阳组的表达水平存在统计学差异(t左归丸组=-35.631，t温肾阳组=-13.000，P<0.01)，且治疗后右归丸组和温肾阳组的表达均较治疗前上升。治疗后各组的SYPL1基因表达存在差异(F=487.049，P<0.01)，温肾阳组表达上升程度不及右归丸组。其他5种基因的表达情况与SYPL1基因状况类似。见表2。

表2　6种基因治疗前后表达

与对照组相比:1)P<0.01;与右归丸组相比:2)P<0.01；与治疗前相比：3)P<0.05

3讨论

阴阳互根互用理论是阴阳学说的重要组成部分。阴阳学说的现代研究中最令人瞩目的是美国生物学家Glodberg等〔7〕于1975年首次提出环磷酸腺苷(cAMP)与环磷酸鸟苷(cGMP)的阴阳假说。随后国际上一系列著名的科学杂志刊登应用阴阳概念探讨免疫与炎症、氧化与抗氧化、蛋白磷酸化信号传导通路、核转录因子抑制与激活等细胞内的诸多事件〔8～13〕。哺乳动物的基因表达具有阴阳属性〔14〕。李白雪〔15〕研究发现miRNA从本质属性上讲，应属于“阴”属性，saRNA呈现积极、向上、促进等“阳”的属性。沈自尹院士曾提出21世纪中医药学的主要发展趋势将是建立中医证的基因表达谱。分子生物学和生命的中心法则认为基因处于最原始和最本质的地位，主宰和制约着表型(蛋白质→细胞→有机体)程序的发生发展〔16〕。

右归丸见明代著名医家张景岳的《景岳全书》，方中以大量温阳药为主，配有几味滋阴药为辅，取“阴中求阳”之义，使元阳得以归原，故得名“右归丸”。所谓“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助，而生化无穷”。本课题组既往研究发现，6条肾虚证共同差异表达下调的基因中，SYPL1(突触泡蛋白样1)的分子学上为转运蛋白，在生物学过程中主要参与运输、突触传递以及传递神经冲动的功能； PHF14(PHD指蛋白14)的分子功能为蛋白结合、锌离子结合及金属离子结合，生物学过程主要参与调控转录和DNA依赖； ARHGAP18(Rho GTP 激活蛋白18)的分子功能为GTP激活、酶激活剂，生物学过程参与新陈代谢、GTP结合；RECQL(RecQ蛋白样、DNA解旋酶Q1样)的分子功能有核苷酸结合、DNA结合、ATP依赖DNA解旋酶、蛋白结合、ATP结合、水解酶等，生物学过程主要参与了DNA的修复、蛋白质的生物合成等； OSTF1(破骨细胞刺激因子1)分布于细胞内，其分子功能主要为蛋白结合、骨骼发育，其生物学过程参与骨化以及信号转导等；SEC23B(Sec23同源物B)分布于细胞膜和内质网及高尔基堆叠等，其分子功能主要有蛋白结合、锌离子结合、高尔基复合体和细胞质囊泡等，生物学过程参与了细胞内蛋白质的运输、内质网高尔基膜泡介导运输等。这6条基因可视为肾阳虚证研究时的特征基因。

本次研究可以总结出右归丸及温肾阳中药复方对老年肾阳虚患者的基因差异表达均有改善作用，右归丸优于单纯温肾阳复方治疗效果，验证了阴中求阳法的优越性。老年肾阳虚患者的基因表达在短期内不能单独依靠药物恢复至完全正常，需要一个长期和综合的治疗过程。

4参考文献

1陆金宝，周如倩，刘仁人，等.老年人肾虚及其证型的调查研究〔J〕.上海中医药大学学报，2002；16(1)：22-3.

2魏敏.肾阴虚证和肾阳虚证基因表达谱的比较研究〔D〕.广州：南方医科大学博士学位论文，2009：4.

3朱文锋.中医诊断学〔M〕.北京：中国中医药出版社，2002：206.

4沈自尹，王文健.中医虚证辨证参考标准〔J〕.中西医结合杂志，1986；(10)：598.

5陈瑾歆，陈建业，李云祥.内参照基因在实时荧光定量RT-PCR检测中的应用〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(14)：2687-8.

6牟丽，曾丽玲，张小虎，等.唑吡坦对大鼠下丘脑内睡眠相关基因表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(17)：2202-3.

7Goldberg ND，Haddox MK，Nicol SE，etal.Biologic regulation through opposing influences of cyclic GMP and cyclic AMP：the Yin Yang hypothesis〔J〕.Adv Cyclic Nucleotide Res，1975;5：307-30.

8Hunter T.Protein kinases and phosphatases：the yin and yang of proteinphosphorylation and signaling〔J〕.Cell,1995;80(2)：225-36.

9Tan YH.Yin and yang of phosphorylation in cytokine signaling〔J〕.Science,1993;262(5132)：376-7.

10Notley CA，Ehrenstein MR.The yin and yang of regulatory T cells andinflammation in RA〔J〕.Nat Rev Rheumatol,2010;6(10)：572-7.

11Chao HT，Zoghbi HY.The yin and yang of MeCP2 phosphorylation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2009;106(12)：4577-8.

12Deng Z，Cao P，Wan M，etal.A multifaceted protein beyond atranscription factor〔J〕.Transcription,2010;1(2)：81-4.

13Becker LC.Yin and yang of MCP-1〔J〕.Circ Res,2005;96(8)：812-4.

14Hahn S.The yin and the yang of mammalian transcription〔J〕.Curr Biol,1992;2(3)：152-4.

15李白雪.非编码RNA调控与中医阴阳理论〔J〕.重庆医学，2014;(5)：613-4.

16De Hoog CL，Mann M.Proteomics〔J〕.Ann Rev Genomics Hum Genet,2004;5：267-93.

〔2015-07-15修回〕

(编辑曲莉)