高效液相色谱-蒸发光检测器法检测茶叶中掺杂糖类物质



高效液相色谱-蒸发光检测器法检测茶叶中掺杂糖类物质

陈 琦1*，李 立2，吴雪原1，储晓刚2，许姗姗1，李德军1，胡 坚1

（1. 黄山出入境检验检疫局茶叶质量安全研究中心，安徽 黄山 245000；

2. 中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

〔摘 要〕使用超声提取与分散基质固相萃取对茶叶中蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖进行提取和净化，使用高效液相色谱-蒸发光检测器（ELSD）法对茶叶4种糖进行测定，蔗糖、葡萄糖、果糖在50 ug/mL～500 ug/mL的线性范围，半乳糖在25 ug/mL～250 ug/mL的线性范围，各组分响应峰面积与其相应浓度呈良好相关性，r>0.995。蔗糖、葡萄糖和果糖在2%，5%，20%添加水平下，半乳糖在1%，2.5%，10%的添加水平下，回收率为92 %～102 %，精密度为0.99%～2.26%。对黄山市休宁县和黟县两个茶叶产区的茶叶进行采样分析，并对其中蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖进行测定以及分析统计。通过对阳性样品进行检测发现：当黄山地区夏秋茶中的蔗糖含量在10%以上，可以基本确定掺加了蔗糖；蔗糖含量在3%～7%之间的为可疑样品。

〔关键词〕茶叶；糖；掺杂；液相色谱；蒸发光检测器

来自中国茶网的报道：“茶叶加糖和喷浆成为了潜规则， 加糖和喷浆主要是对夏秋茶加糖或喷浆达到美化外形和改善口感的目的，由于夏秋茶的茶叶嫩度差，外形松散，只有通过糖的粘性特性来达到收缩外形的目的，通过加糖也能大大提升茶叶的光泽度，更有甚者，通过添加大量的糖来增加茶叶的重量”（http://www.chinateaw.net/）。茶叶中糖类物质掺杂使假已成为我们面临的重大问题。另外一方面，由于夏秋茶叶中多酚物质含量高，氨基酸含量低，口感苦涩，适量的加糖能够有效的改善口感，降低苦涩感。《GB/T 2760- 2011食品添加剂使用标准》规定：食品添加剂使用时，不应掩盖食品本身或加工过程中的质量缺陷或以掺杂、掺假、伪造为目的而使用[1]。

目前针对茶叶掺杂使假行为有一定的检测手段：使用标准方法对茶叶中的灰分[2]、水浸出物进行测定来初步判断掺杂使假；使用荧光PRC鉴定茶叶中小麦掺杂[3]；使用原子吸收光谱法鉴定石灰、硫酸镁等矿物质的掺伪[4]；热分析法检测苦丁茶掺杂葡萄糖[5]。目前用于茶叶掺伪鉴定主要还是依靠感官审评进行判断。无论是用感官鉴定还是理化检测，都很难评测茶叶中糖类物质含量是否符合正常范围。检测食品单糖和双糖的方法有化学法、液相色谱法等[6- 8]和质谱法[ 9]。本研究开展高效液相色谱-蒸发光检测器（ELSD）法对茶叶中蔗糖、葡萄糖、果糖进行测定以及T分布分析统计，来达到识别茶叶中糖类物质掺杂使假鉴定的目的。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

样品：茶叶采摘于黄山休宁县和黟县（由黄山本地茶厂按照给定工艺加工）。

乙腈（色谱纯）；超纯水；固相萃取填料：石墨化碳（Carb）填料、N-丙基乙二胺（PSA）固相萃取填料和C18固相萃取填料（Agilent, 120 μ m）。

蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖标准品（纯度≥99 %，百灵威）。

1.2仪器与设备

1200高效液相色谱仪（美国Agilent，配有1260 ELSD）；涡旋混匀器；离心机（德国Hettich）。

1.3方法

1.3.1各种溶液的配制

4种糖标准储备液：分别准确称取0.25g蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖标准品于50 mL容量瓶中，加水定容，配置5 mg/mL蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖标准储备标准液。

4种糖混合标准工作液：分别移取2 mL 蔗糖、2 mL葡萄糖、2 mL果糖和1 mL半乳糖储备标准溶液至10 mL容量瓶中，定容至刻度。

1.3.2样品前处理

称取茶叶2.00 g置于50 mL离心管中，加入20 mL纯水，涡旋振荡2min，超声处理1 min，最后离心5min（5000 rpm）。取1 mL上清液置于离心管中，加入1 mL乙腈，使用50 mg PSA固相萃取填料涡旋净化1 min，离心5min(6000 rpm)，过0.22μ m有机系滤膜，稀释合适的倍数进行分析。

1.3.3色谱分析

液相色谱柱：NH2柱（5μ m，4.6×250mm，GL Sciences Inc，日本）；色谱柱温：40℃；检测器：蒸发光检测器（ELSD）；流动相：乙腈-水（70:30 （v/v））；流速1 mL/min；进样体积：5μ L。

ELSD参数：蒸发温度 90℃，雾化温度 50℃，氮气流速1.0L/min(SLM)。

2　结果与分析

2.1 流动相的选择

流动相比例的选择：流动相比例影响流动相的洗脱能力，水相比例越高，洗脱能力越强，但是分离度越低，水相比例降低，洗脱能力减小，分离度随之增加，但是容易造成色谱峰展宽和拖尾，对灵敏度和分离效果产生不良影响。本研究比较了乙腈与水比例为80:20（v/v），70:30（v/v），60:40（v/v）和50:50（v/v）的分离效果，结果表明当乙腈与水比例为70:30（v/v）分离效果和灵敏度最为理想（见图1）。

2.2仪器检出限、检测限及线性

蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖的仪器检出限按信噪比（S/N=10）计算，蔗糖50 ug/mL，葡萄糖50 ug/mL，果糖50 ug/mL，半乳糖25 ug/mL的浓度下，其信噪比≥10；蔗糖1000 ug/mL，葡萄糖1000 ug/mL， 果糖1000 ug/mL，半乳糖1000 ug/mL的浓度下，其ELSD响应饱和，出现了平头色谱峰，蔗糖、葡萄糖、果糖在50 ug/mL～500 ug/mL的线性范围内建立校准曲线，其线性系数≥0.995；半乳糖在25 ug/mL～250 ug/mL的线性范围内建立校准曲线，其线性系数≥0.995。4种糖类物质的仪器检出限及线性范围见表1。

图1　四种糖标准物质的色谱图

表1　方法的线性实验结果和检出限

2.3前处理优化

蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖均为水溶性化合物，在水中易溶，因此选择纯水作为提取溶剂，在提取茶叶中单双糖的同时，茶叶中的一些水溶性物质也被提取出来，会对糖的色谱分析造成干扰，因此需要对提取液进行净化，茶叶中水溶性物质主要有氨基酸、生物碱、有机酸、黄酮类物质、花青素及茶多酚氧化产物茶黄素、条红素和茶褐素，本研究考虑了不同固相萃取填料在不同的溶剂体系中的净化效果。

2.3.1 固相萃取填料的选择

对茶叶水溶液中的干扰物质有吸附作用的主要有石墨化碳（Carb）填料、N-丙基乙二胺（PSA）固相萃取填料和C18固相萃取填料，PSA吸附剂能有效去除样品中的脂肪酸等极性基质杂质，C18吸附剂能去除部分非极性脂肪和脂溶性杂质，石墨化碳黑能去除色素和固醇类杂质。实验对不同固相萃取填料对四种糖类物质的吸附率进行测试，结果表明三种固相萃取填料在水或乙腈-水（1：1）中对目标分析物无明显吸附。但是，通过对样品基质加标得到的提取溶液进行净化，实验发现PSA对样品基质的净化效果最好。

在2 mL的200 mg/L的混合标准溶液（溶剂为水）分别添加50 mg PSA、C18、Carb进行净化处理，吸附处理结果表明：三种固相萃取填料在水溶液中对四种糖类物质无明显吸附。

在2 mL的200 mg/L的混合标准溶液（溶剂为乙腈-水（1：1））分别添加50 mg PSA、C18、Carb进行净化处理，吸附处理结果表明：三种固相萃取填料在乙腈-水（1：1）溶液中对四种糖类物质无明显吸附。

2.3.2 提取液的溶剂体系对净化效果影响

确定了净化固相萃取填料后，为了降低溶剂对提取液中水溶性的杂质的保留能力，研究往提取水溶液中加入乙腈等有机溶剂降低溶剂的极性来减少色素、有机酸和少量蛋白质、氨基酸等水溶性杂质在溶液中的保留强度，增加固相萃取填料吸附效率。实验结果表明：往提取液中加入等体积的乙腈可以有效的增加PSA固相萃取填料对水溶性杂质的吸附效率。

2.4检测方法的回收率和精密度

使用正常加工得到的茶叶样品，分别添加2%，5%和20%的蔗糖、葡萄糖和果糖以及1%，2.5%和10%的半乳糖。每个添加水平样品平行测定7次，同时测定样品中的糖含量，减去茶叶本身的含糖量计算平均回收率和相对标准偏差，结果见表2。

表2　方法的准确度和精密度实验结果(%)

3　休宁县及黟县夏秋茶固有含糖量统计分析

对黄山的休宁县和黟县两个主要出口茶叶地区不同地点进行采样，经过采摘→摊凉→杀青（220℃）→揉捻→初烘（120℃，10 min）→足干（90℃，20 min）步骤进行加工，对这两个地区的夏秋茶样品（样本量均为27个）进行检测，所有样品均未检出半乳糖，统计分析结果见表3。

在样品量足够的前提下，对相同时间相同地区采摘的茶叶中的各种糖含量利用T分布进行统计分析，通过计算样品的中位值和标准差分析结果显示：

休宁县的夏秋茶：果糖含量的中位值为0.15 %，标准差0.11 %；葡萄糖含量的中位值为0.18 %，标准差0.07 %；蔗糖含量的中位值为1.07 %，标准差0.43 %。

黟县的夏秋茶：果糖含量的中位值为0.12%，标准差0.06%；葡萄糖含量的中位值为0.22 %，标准差0.10 %；蔗糖含量的中位值为0.94 %，标准差0.60 %。

表3　黄山地区的茶叶中含糖量的统计分析

4　样品检测分析

茶叶加糖是为了对夏秋茶进行美化外形，由于夏秋茶的茶叶嫩度差、外形松散，通过糖的粘性特性来可以达到收缩外形的目的，也能大大提升茶叶的光泽度，更有甚者，通过添加大量的糖来达到增加茶叶的重量的目的。通过到茶叶生产企业调查研究，要达到收缩茶叶外形和提升茶叶的光泽度的目的，加糖量通常在5%～25%之间，因此在进行糖添加阳性样品分析时，需要对提取和净化后的溶液稀释25倍，确保进样液中糖类物质浓度在线性范围内再进行色谱定量分析。

通过对出口茶叶及市场上的低端茶叶进行检测，发现有蔗糖添加可疑样品，检测到的含量分别为8.92%、19.32 %、17.20 %、12.05 %、14.89 %、14.83 %、23.53 %、18.38 %、17.19 %、13.21 %、20.71 %和10.44 %，未发现有蔗糖含量在3%～7%之间的样品，也未检测果糖和葡萄糖含量异常的样品。

以上证据表明：当夏秋茶中的蔗糖含量在10%以上，可以基本确定掺加了蔗糖；当蔗糖含量在3%～7%之间的样品，为可疑样品。

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（责任编辑：章传政）

〔收稿日期〕2014-10-13

〔文章编号〕1006-5768(2015)01-0026-04

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕TS201